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逆境会使植物细胞积累大量的活性氧,如果这些活性氧得不到有效清除就会对植物造成伤害。植物体内活性氧清除系统主要包括酶促清除系统和非酶系统两大类。抗坏血酸过氧化物酶是一种亚铁血红素蛋白,它以抗坏血酸为电子供体将H2O2分解为水,在植物体内的活性氧清除中发挥着重要作用。其同工酶定位于细胞的几个不同部位,其中叶绿体抗坏血酸过氧化物酶已被认为是叶绿体中清除H2O2的关键酶。
花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)是一种组成型启动子,是目前基因工程中最常用的启动子,它在生物体的不同组织器官、不同发育阶段均可启动基因表达;而拟南芥rd29启动子是一种胁迫诱导型启动子,仅在高盐、低温、干旱或ABA诱导时才会启动基因表达。
本研究利用pBI121-APX、pBI101-RD29-APX重组质粒,通过农杆菌介导的叶圆盘转化法将目的基因片段导入741毛白杨基因组中获得转基因毛白杨,分析组成型表达和诱导表达APX基因对毛白杨抗逆能力的影响。本论文主要结果如下:
1)PCR及实时定量PCR:PCR结果显示,以转基因毛白杨叶片基因组DNA为模板,用NPTII引物能扩增出特异DNA片段,而野生型植株未见特异条带,说明pBI121-APX、pBI101-RD29-APX基因片段可能已导入毛白杨基因组中。实时定量PCR结果显示,正常条件下转35S-APX植株APX水平高于对照,而转RD29-APX植株植株与对照没有明显差别。说明35S-APX基因片段可能确已在植物体内得到表达。
2)MV处理:MV处理结果显示,0.02mM的MV处理,28℃、强光下培养4天,对照及转35S-APX植株、转RD29-APX植株的实验叶片都遭到了伤害,且对照植株叶片受伤害程度最大。本文进而对其叶片的总叶绿素含量做了分析,数据显示转基因植株比对照植株叶片总叶绿素含量下降的稍少。
3)盐处理:50mMNaCl处理(5周)毛白杨试管苗几乎完全抑制了对照植株生根,而转35S-APX植株、转RD29-APX植株仍然可以生根,同时发现诱导表达APX的转基因苗在25mMNaCl下比50mM时受伤害程度更大。对照及转基因毛白杨在溶液培养条件下,经50mMNaCl胁迫处理四天,其叶片APX和SOD活性都升高,而MDA含量都增加且对照增幅最大。