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细胞黏附是细胞之间信息交流和传递的一种形式。钙黏附蛋白家族是一类具有钙离子依赖性的黏附分子。原钙黏附蛋白是钙黏附蛋白家族中最大的亚族，原钙黏附蛋白18(Protocadherin18，Pcdh18)是原钙黏附蛋白亚家族的成员。在斑马鱼中已发现Pcdh18的两个同源蛋白Pcdh18a和Pcdh18b，同源性达70％。虽然两者的表达模式不尽相同，但都在斑马鱼胚胎发育过程中的中枢神经系统处表达。哺乳动物与斑马鱼的的Pcdh18有一半以上的氨基酸完全相同，说明哺乳动物中的Pcdh18表达与定位可能和在斑马鱼中具有极高的相似性。 为了研究原钙粘附蛋白在神经系统中的生物学功能，生物学家们利用基因敲除技术除去相关基因，对基因敲除小鼠的神经系统发育进行观察。这也是探究Pcdh18基因功能的主要思路。将RNA干扰技术与转基因小鼠技术相结合，以Tet系统介导RNA干扰过程，从外部精确调控靶基因表达的干扰程度，规避胚胎死亡，又能获得缺陷表型倒推Pcdh18的基因功能。 本研究旨在筛选出高效抑制mPcdh18表达的siRNA序列，建立并鉴定诱导表达mPcdh18-siRNA的LLC稳定细胞株，为日后RNAi转基因小鼠模型的建立打下基础。本研究分以下两部分进行。 1.Tet系统诱导mPCDH18-siRNA在293T细胞中的表达 针对mPcdh18基因序列设计并体外合成三对siRNA，包括一对无关序列。利用本实验室已成功构建的mPcdh18与pEGFP-N1的融合表达载体pEGFP-mPcdh18，分别与三对siRNA瞬时共转染293T细胞，并设置空白对照，在荧光显微镜下观察荧光强度，并以RT-PCR手段进行mRNA水平检测，得到基因抑制效率。实验结果表明，所设计的siRNA序列都具有较强的抑制效果。 将三对siRNA对应的反向互补DNA序列与pSingle-tTS-shRNA载体通过“酶切-连接”方式构建融合表达载体pSingle-tTS-shRNA。与pEGFP-mPcdh18瞬时共转染293T细胞，并以适当浓度DOX诱导，观测荧光强度并检测mRNA表达水平，得到基因抑制效率。实验结果表明，所设计的siRNA序列在Tet系统内仍然具有较强的抑制效果。 2.稳定诱导表达mPCDH18-siRNA的LLC细胞株的建立及鉴定 以RT-PCR和Western-Blotting手段筛选数种鼠源及人源细胞，证实LLC细胞内有mPcdh18基因和蛋白高表达。将pSingle-tTS-shRNA重组质粒转入LLC细胞，G418筛选得到稳定细胞株。以qRT-PCR和Western-Blotting手段，测定不同浓度DOX诱导下，稳定细胞株mPcdh18的表达水平。结果显示，LLC细胞内mPcdh18的表达水平随着DOX浓度的增加呈明显的降低趋势，在DOX浓度1000μg/ml左右达到最强抑制效率，趋近80％。观察稳定细胞株的增值活性和细胞形态变化，并测定其生长曲线和细胞迁移能力，发现细胞增值活性降低，细胞状态变差，迁移能力也有减弱。 综上所述，本研究已筛选出高效抑制mPcdh18表达的两对siRNA片段，成功建立并鉴定了由Tet-on系统调控mPcdh18-siRNA表达的LLC稳定细胞株，为后续RNAi转基因小鼠模型的建立打下了基础。