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心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)是各种心脏疾病发展到某个阶段的常见病理变化。病理情况下,心肌损伤伴有正常的心肌细胞坏死和心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)的激活,后者持续增殖并释放导致MF的纤维化因子。发生MF时,心室壁的顺应性降低,心室舒张受到限制,进一步损害心肌功能。因此,减少或延缓MF并探索可能的机制已成为心血管疾病中亟待解决的问题。心脏受到病理刺激时,激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin-aldosterone system,RAAS),产生血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ),诱导MF的发生和细胞外基质的胶原累积。有研究表明,在许多心脏疾病中存在类AngⅡ的物质——血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体(autoantibodies against angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1-AA),该自身抗体可通过与血管紧张素Ⅱ 1型受体的细胞外第二环肽段(AT1R-ECⅡ)特异性结合发挥Ang Ⅱ样激动作用。那么,AT1-AA是否也能引起心肌纤维化及如何影响待进一步探讨。心肌纤维化是一种慢性的炎症反应,心脏受损时,促进诸如白介素家族等因子的激活和释放,其中白介素-1β(IL-1β)是与炎症相关研究最多的因子之一,且对心血管疾病具有重要影响。当受到刺激时,IL-1β被IL-1β转化酶(Caspase1)裂解并激活。Caspase1可被NLRP3炎症体激活,使两个相邻的Caspase1发生自身水解,裂解为P10和P20片段以发挥生物学活性。研究发现,AngⅡ可以诱导炎症反应和IL-1β分泌。那么,AT1-AA是否也可诱导IL-1β分泌,NLRP3炎症体是否参与其中,又是如何影响心肌纤维化呢?哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是酵母雷帕霉素靶蛋白的同源物,其主要通过调节胶原蛋白分泌促进心肌纤维化的发展。在许多疾病中,mTOR可以激活NLRP3炎症体的表达,如果AT1-AA能诱导NLRP3炎症体的激活和MF,那么mTOR在此过程中是否发挥作用?因此,本研究探讨AT1-AA长期存在是否可以诱导MF,以及mTOR-NLRP3炎症体-IL-1β途径是否参与了这一过程。目的:1.建立AT1-AA阳性大鼠模型,观察大鼠心脏形态、功能以及mTOR,NLRP3炎症体和IL-1β变化。2.证实mTOR-NLRP3-IL-1β通路在AT1-AA诱导心肌纤维化中的作用。方法:1.AT1-AA阳性大鼠模型的建立:用佐剂(第一次用完全佐剂,以后用不完全佐剂)、Na2CO3溶液和生物合成的AT1R-ECⅡ抗原肽段按比列配制乳浊液,对SD大鼠进行主动免疫;对照组用生理盐水溶于佐剂做对照。免疫方式为:背部皮下注射(第一次为皮下多点注射,以后加强免疫为皮下单点注射)。2.分离提纯AT1-AA。3.小动物超声检测心脏结构和功能的损伤。4.HE染色观察心脏结构变化。5.Masson染色检测心脏的胶原沉积。6.免疫组织化学染色法观察心脏胶原蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ和NLRP3蛋白的表达水平。7.Western blot检测p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC、Caspase1蛋白的表达水平。8.ELISA检测AT1-AA滴度和IL-1β分泌量。9.免疫荧光染色法检测心肌成纤维细胞胶原蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达。结果:1.成功建立AT1-AA阳性大鼠模型用人工生物合成的抗原肽段主动免疫SD大鼠,2周(week,w)一次。ELISA实验表明,与Vehicle组相比,大鼠血清中的抗体滴度随着免疫时间的增加而逐渐增加。第2w时其滴度即增加(P<0.05),第8w时AT1-AA抗体滴度达到峰值随后一直维持(P<0.01),以上结果提示AT1-AA阳性大鼠模型成功构建(图1)。2.AT1-AA阳性大鼠出现心肌纤维化超声检测结果显示,与Vehicle组相比,AT1-AA阳性大鼠在12w时心脏结构就有所破坏。具体表现为代表心脏功能的指标EF和FS以及代表心脏结构的指标IVSd和IVSs降低(P<0.05)。到免疫16w时,心脏的结构损伤和功能进一步降低(图2A-2E)。HE染色显示,与Vehicle组相比,AT1-AA阳性大鼠的心脏结构在免疫早期没有明显损伤;免疫12w时大鼠心肌纤维破裂,细胞排列紊乱,大鼠心肌细胞增大,细胞核大小出现明显不同,部分心肌细胞溶解;免疫16w时心脏损伤更为明显(图3)。Masson染色显示,与Vehicle组相比,AT1-AA阳性大鼠从第4w开始出现胶原沉积。随着免疫时间的延长,到第12w和第16w,心肌细胞间隙增加,且沉积在心肌间隙中的胶原纤维增加(P<0.05,图4)。免疫组织化学染色(IHC)检测结果显示,与Vehicle组相比,随着免疫时间的延长,AT1-AA阳性大鼠的Ⅰ型胶原蛋白CollagenⅠ(ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白CollagenⅢ(ColⅢ)都增加,且ColⅠ/ColⅢ比值增加(P<0.01,图5A,5B)。以上结果提示AT1-AA可以促进心肌纤维化。AT1-AA阳性大鼠心脏结构和功能受损,胶原沉积。3.AT1-AA促进心脏NLRP3炎症体表达和IL-1β分泌IHC结果显示,与Vehicle组相比,AT1-AA组的大鼠心脏NLRP3蛋白的表达随免疫时间的增加而增加(P<0.05,图6A,6B)。Western blot结果表明,与Vehicle组相比,NLRP3炎症体各蛋白NLRP3,ASC,P10和caspase 1的表达随免疫时间的增加而增加(P<0.05,图6C-6G)。ELISA检测结果表明,随着免疫时间的增加,免疫大鼠血清中IL-1β的分泌逐渐增加(P<0.01,图7)。以上结果提示AT1-AA可以促进心脏NLRP3炎症体的表达和血清中IL-1β的分泌。4.NLRP3炎症体参与了AT1-AA诱导的心肌纤维化IHC结果显示,与AT1-AA组相比,NLRP3炎症体的抑制剂MCC950可以抑制免疫大鼠心脏NLRP3蛋白的表达下降(P<0.05,图8A,8B)。Western blot结果表明,与AT1-AA组相比,给予MCC950后,免疫鼠的心脏NLRP3炎症体表达下降(P<0.05,图8C-8G)。ELISA检测结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组中大鼠心脏的IL-1β分泌明显下降(P<0.01,图9)。以上结果提示,MCC950可以抑制NLRP3炎症体的表达并减少IL-1β的分泌。超声结果显示,与AT1-AA组相比,MCC950改善了AT1-AA引起的心脏功能下降和结构的损伤。具体表现为EF,IVSs和IVSd有所恢复(P<0.05),FS有所改善但无统计学意义(P<0.05,图10A-10E)。HE染色结果表明,与AT1-AA组相比,给予MCC950后心肌纤维断裂现象明显改善,心肌细胞相对致密,排列较整齐,核大小均一,胞间质较少(图11)。Masson染色显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组大鼠的心肌细胞染色更整齐,心肌基质中沉积的胶原蛋白较少(P<0.05,图12)。IHC染色结果表明,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组大鼠的心脏组织中ColⅠ和ColⅢ都减少,且ColⅠ/ColⅢ比值下降(P<0.05,图13A,13B)。以上结果提示NLRP3炎症体参与了AT1-AA诱导的心肌纤维化。5.AT1-AA阳性大鼠心脏组织中p-mTOR/mTOR蛋白的表达增加Western blot结果表明,与Vehicle组相比,随着免疫时间的增加,AT1-AA组心脏组织中p-mTOR/mTOR的表达增加(P<0.05,图14)。结果提示AT1-AA可以激活mTOR的表达。6.mTOR参与AT1-AA诱导的心脏NLRP3炎症体表达、IL-1β分泌和胶原沉积分离大鼠心脏成纤维细胞,通过Western blot检测不同组别的表达。与AT1-AA组相比,加入mTOR抑制剂——雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)后,p-mTOR/mTOR和NLRP3炎症体各蛋白的表达都降低(P<0.05,图15A-15F)。ELISA结果显示,与AT1-AA组相比,加入RAPA后,IL-1β分泌明显减少(P<0.01,图16)。细胞免疫荧光染色结果显示,与Vehicle组相比,加入AT1-AA的心脏成纤维细胞中ColⅠ和ColⅢ的表达增加,而加入RAPA后,AT1-AA诱导的ColⅠ和ColⅢ的表达降低(图17A,17B)。以上结果提示,mTOR参与AT1-AA诱导的心脏NLRP3炎症体表达、IL-1β分泌和胶原沉积。7.AT1-AA致心脏组织炎症体的产生、IL-1β分泌及心肌纤维化是由血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin Receptor,AT1-R)介导Western blot结果表明,与AT1-AA组相比,加入血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(Angiotensin Receptor Blocker,ARB)类药物替米沙坦(telmisartan,TM)的大鼠心脏的NLRP3炎症体的表达降低,p-mTOR/mTOR的表达也降低(P<0.05,图18A-18F)。ELISA结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组的大鼠血清中IL-1β的分泌减少(P<0.01,图19)。超声结果表明,ARB可以改善AT1-AA引起的心脏功能下降和结构损伤。具体表现为,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组的大鼠心脏IVSs和IVSd增加;FS和EF也有改善,但无统计学差异(P<0.05,图20A-20E)。HE染色结果表明,ARB可以改善AT1-AA诱导的心肌结构损伤和心肌纤维断裂(图21)。Masson染色结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组大鼠的心肌细胞排列更整齐,心肌间质中的胶原沉积较少(P<0.05,图22)。IHC结果表明,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组的大鼠心脏组织中ColⅠ和ColⅢ都减少,且ColⅠ/ColⅢ比值下降(P<0.05,图23A,23B)。以上结果提示ARB可以减少由AT1-AA诱导的NLRP3炎症体的表达,IL-1β的分泌和心肌纤维化。AT1-AA可以通过AT1-R诱导NLRP3炎症体表达,IL-1β分泌并增强心肌纤维化。结论:1.AT1-AA长期存在可导致大鼠心肌纤维化、心脏结构和功能受损,同时可促进心脏组织m TOR、NLRP3炎症体以及IL-1β的水平升高。2.m TOR-NLRP3-IL-1β信号途径参与AT1-AA诱导的心肌纤维化。3.AT1-AA通过AT1-R发挥作用,激活m TOR-NLRP3-IL-1β通路参与AT1-AA诱导的心肌纤维化。