大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,据报道每年全球新增发病例数高达120多万,每年逾60万人死于大肠癌。近年来我国大肠癌的发病率和死亡率逐年递增,且有年轻化趋势,严重威胁患者的生命和健康。虽然手术切除是目前治疗大肠癌的首选方式,但对于术后复发及失去手术机会或转移性大肠癌患者,化疗仍是其主要治疗手段。而大肠癌多药耐药(MDR)的产生是目前临床大肠癌化疗失败的主要原因之一,进而导致肿瘤的复发、转移。虽然随着各学科的飞速发展,为逆转耐药带来了新的思路；但无论是传统的化学逆转剂还是基因逆转、免疫逆转等新策略,或因为机制单一、毒副作用大、或因为使用难度高等原因,限制了临床的使用。因此,寻求安全、有效的耐药逆转剂以提高大肠癌对化疗的敏感性和逆转其MDR,成为临床医生和科研工作者共同关注的目标,并对提高临床疗效和改善患者的生活质量具有重要的科学价值和现实意义。肿瘤MDR是指化学治疗过程中肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药性的同时,对其它作用机制不同、结构不同的药物也产生耐药性的现象。MDR产生的机制是一个复杂的过程,是多基因、多途径共同参与的结果,多药耐药的产生取决于肿瘤细胞内药物浓度、药物作用靶点,以及靶点和药物间相互作用等；其机制包括药物外排增加、损伤修复增强、细胞凋亡抵抗、相关信号通路调控异常以及miRNA表观遗传学调控异常等。因此,围绕这些研究能够较系统地阐明药物逆转大肠癌MDR的作用及其分子机制。前期研究表明白花蛇舌草(HDW)治疗大肠癌疗效明确,可诱导大肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖和肿瘤血管新生及逆转肿瘤耐药的作用,但其逆转大肠癌MDR的作用研究尚不系统,且其具体作用机制也未阐明。因此,研究白花蛇舌草逆转大肠癌MDR的作用及其作用机制,将进一步为该药用于临床治疗大肠癌提供合理、准确的理论依据。第一部分 白花蛇舌草提取物的制备目的：制备质量稳定、可靠的白花蛇舌草提取物。方法：采用乙醇回流提取的方法制备白花蛇舌草乙醇提取物(EEHDW),分别以芦丁和没食子酸作为标准检测EEHDW的黄酮类和酚类化合物含量；采用HPLC分析法检测EEHDW的指纹图谱；采用酸度计检测EEHDW的pH值。结果：乙醇水溶液可以将白花蛇舌草中总黄酮及总酚成分有效的提取出来；EEHDW的总黄酮含量为71.534 mg/g、RSD为1.146%,总酚含量为111.272 mg/g、RSD为0.683%,建立了HPLC指纹图谱,其pH值为7.0,且该方法精密度,稳定性,重复性良好。结论：本研究可用于白花蛇舌草提取物的质量控制,并获得了质量稳定、可控、标准的EEHDW,可为后续的细胞实验和动物实验研究提供药物保障。第二部分 白花蛇舌草对大肠癌细胞耐药的逆转作用及其机制研究目的：探讨白花蛇舌草乙醇提取物(EEHDW)对大肠癌HCT-8/5-FU细胞MDR的逆转作用及其对HCT-8/5-FU细胞药物外排、细胞增殖凋亡、相关信号通路活化和miRNAs表达的影响。方法：采用MTT法检测细胞活力验证大肠癌HCT-8/5-FU细胞的多药耐药性及EEHDW的逆转作用；分别采用HPLC分析、倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪(FCM)检测5-FU、阿霉素(ADM)和罗丹明(Rh123)在细胞内的蓄积探讨EEHDW对HCT-8/5-FU细胞药物外排功能的影响；采用MTT检测细胞活力、显微镜观察细胞形态、集落形成检测细胞存活、FCM检测细胞周期等研究EEHDW对HCT-8/5-FU细胞增殖的影响；采用DAPI染色、AnnexinV/PI染色FCM分析研究EEHDW对HCT-8/5-FU细胞凋亡的影响；采用Transwell和细胞粘附实验观察EEHDW对HCT-8/5-FU细胞迁移、侵袭和粘附的影响;采用RT-PCR和Western Blot检测EEHDW对HCT-8/5-FU细胞药物外排相关因子(ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP)、细胞增殖调控因子(Cyclin D1)、CDK4、p21)、细胞凋亡调控因子(Bcl-2、Bax)的mRNA和蛋白表达的影响；采用Western Blot检测EEHDW对HCT-8/5-FU细胞ERK、JNK、p38、PI3K/AKT信号通路活化的影响；采用miRNA表达谱芯片检测分析和QPCR验证检测EEHDW对HCT-8/5-FU细胞miRNAs表达的影响。结果：HCT-8/5-FU细胞株具有多药耐药性,可作为大肠癌MDR的细胞模型;EEHDW可增加HCT-8/5-FU细胞对5-FU的敏感性：EEHDW能增加5-FU、ADM、Rh123的细胞内蓄积,抑制细胞的药物外排功能；EEHDW可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,抑制细胞的迁移、侵袭和粘附；EEHDW能显著下调细胞中ABCC1/MRP1、 ABCB1/P-gp、 ABCG2/BCRP、Cyclin D1、CDK4、Bcl-2的mRNA和蛋白表达,上调p21、Bax的mRNA和蛋白表达,并具有一定的剂量依赖作用；EEHDW对HCT-8/5-FU细胞ERK1/2、JNK、p38、PI3K/Akt等信号转导通路活化有显著的抑制作用；EEHDW对HCT-8/5-FU细胞的miRNA表达具有广泛的调控作用,能上调HCT-8/5-FU细胞中miR-92b、miR-1247、miR-4800-5p、miR-1224、miR-1260、miR-4669、miR-4298的表达,抑制miR-582-5p、miR-4454、miR-222、miR-483-5p、miR-4443的表达。结论：大肠癌HCT-8/5-FU细胞具有多药耐药性；EEHDW具有逆转大肠癌MDR的作用；通过调控多药耐药相关因子和细胞增殖凋亡相关因子表达、多条信号转导通路活化和多个miRNAs表达是EEHDW逆转大肠癌MDR的重要作用机制。第三部分 白花蛇舌草对裸鼠大肠癌耐药移植瘤生长的抑制作用及其机制研究目的：探讨白花蛇舌草乙醇提取物(EEHDW)在体情况下对大肠癌耐药移植瘤生长的抑制作用及其分子作用机制。方法：采用雄性BALB/c裸鼠接种大肠癌HCT-8/5-FU细胞及HCT-8细胞构建皮下移植瘤动物模型,通过5-FU干预给药验证大肠癌HCT-8/5-FU移植瘤的耐药性；大肠癌HCT-8/5-FU移植瘤耐药模型裸鼠分为对照组(生理盐水)、EEHDW、5-FU及EEHDW联合5-FU干预等4组,分别给予相应药物干预处理6周,通过检测移植瘤体积和重量研究EEHDW对大肠癌耐药移植瘤生长的影响；通过PCNA和TUNEL检测研究EEHDW对HCT-8/5-FU移植瘤细胞增殖和凋亡的影响；采用RT-PCR和IHC检测EEHDW对移植瘤组织药物外排相关因子(ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP)、细胞增殖周期调控因子(Cyclin D1、CDK4、p21)、细胞凋亡调控因子(Bcl-2、Bax)的mRNA和蛋白表达的影响；采用Western Blot检测EEHDW对移植瘤细胞ERK、JNK、p38、PI3K/AKT信号通路活化的影响；采用QPCR检测EEHDW对移植瘤细胞miRNAs表达的影响。结果：构建的裸鼠大肠癌HCT-8/5-FU细胞移植瘤对5-FU具有耐药性,可作为大肠癌耐药研究的动物模型；EEHDW及联合组能显著抑制移植瘤的生长,且联合治疗疗效更佳；EEHDW及联合组可抑制大肠癌耐药移植瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡；EEHDW及联合组可显著抑制HCT-8/5-FU移植瘤细胞中ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、Bcl-2、Cyclin D1、CDK4的mRNA和蛋白表达,促进p21、Bax的mRNA和蛋白表达；EEHDW及联合组能抑制HCT-8/5-FU移植瘤细胞ERKl/2、JNK、p38和PI3K/Akt等信号通路的活化；EEHDW及联合组可上调HCT-8/5-FU移植瘤细胞miR-92b、miR-1247、miR-4800-5p、miR-1224、miR-1260、miR-4669、miR-4298的表达,下调miR-582-5p、miR-4454、miR-222、miR-483-5p、miR-4443的表达。结论：成功构建了大肠癌耐药移植瘤动物模型；EEHDW在体具有抑制大肠癌耐药移植瘤生长的作用,可增加移植瘤细胞对5-FU的敏感性；EEHDW在体对大肠癌耐药移植瘤耐药相关因子和细胞增殖凋亡相关因子表达、相关信号转导通路活化和miRNAs表达有显著调控作用。