茶树中三个与茶尺蠖取食诱导相关的肉桂醇脱氢酶(CAD)基因克隆与功能分析

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:just_username
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
木质素是由多种简单的苯丙烷及其衍生物聚合形成的复杂聚合物,其通过有效物理化学屏障在植物抵抗病、虫害侵入中起着重要作用。而肉桂醇脱氢酶(CAD)是控制木质素生物合成途径的关键酶之一,然而茶树体内CAD基因相关研究及其与抗虫性之间的关系研究至今未见报道。本论文主要对茶树叶片中的三个与茶尺蠖取食诱导相关的CAD基因进行了cDNA克隆,鉴定和表达特征分析。主要结果如下:1.基于本课题组建立的茶树被茶尺蠖取食诱导前后的cDNA消减杂交文库(SSH)和茶树全器官转录组库获得的3条与CAD基因同源性很高的EST序列,利用RACE技术分别克隆了编码CAD基因的全长cDNA序列,其中1条来自于SSH编码的CAD命名为CAD2,2条来自于转录组库编码的CAD分别命名为CAD1和CAD3。CAD2基因全长为1574bp,开放阅读框972bp,编码324个氨基酸;CAD1基因全长为1386bp,开放阅读框1146bp,编码382个氨基酸; CAD3全长为1350bp,开放阅读框1083bp,编码361个氨基酸。并将三个基因的序列递交到GenBank,登录号分别为HM440158、HQ880207和HQ880208。2.多序列同源比对和蛋白质结构预测分析表明, CAD1和CAD3之间同源性为54%,而两者与CAD2同源性比较低,仅为20%。只有CAD1和CAD3含有二者共有的3个保守的功能结构域:Zn1结合位点[GHE(X)2(X)5G(X)2V], Zn2结合位点[GD(X)9.10C(X)2C(X)2C(X)7C]和NADPH辅酶结合位点[GXG(X)2G];仅CAD2含有依赖于NADPH的表异构酶/脱水酶家族的氧化还原酶功能结构域。进化树分析结果表明,CAD1、CAD2和CAD3分属于3个不同的家族。3.原核表达结果表明,CAD2基因表达的蛋白大部分是分布于上清的可溶性蛋白,分子量为53kD,而CAD1和CAD3基因表达的蛋白皆形成包涵体,分子量分别为59kD与56kD。酶活测定结果发现,三个CAD基因表达的蛋白质具有不同的催化活性,其中以CAD2活性最高,为0.43μmol·min-1· mg-1, CAD3次之,为4.2nmol·min-1· mg-1, CAD1最小,为3.8nmol·min-1· mg-1。 CAD2的最适pH为6,最适温度为30℃,酶动力学参数Km为1.974μmol·L-1, Vmax为1.7437μmol·min-1· mg-1。4.利用Southern blot技术分析发现,茶树基因组中的CAD1和CAD2基因均以双拷贝存在,而CAD3基因则是以单拷贝形式存在。5.茶尺蠖取食诱导3个CAD基因的表达量不尽相同,其中CAD1和CAD2间的诱导表达量的最大值差异不大,但是二者各自与CAD3的差别要明显大于CAD1和CAD2间的差异;三个基因的诱导表达量皆存在品种间差异,总体表现为舒茶早大于龙井43;从诱导表达规律上来说,三个基因也存在差异,CAD1和CAD2表达量均是随着取食后时间增加而缓慢增加,最大值分别出现在24h和9-12h之间,而CAD3是先急剧增加至最大值,紧接着急剧下降,最大值则出现在3-6h之间。而单独的机械损伤处理后,三个基因间的最大表达量差异与茶尺蠖取食诱导的类似,但是品种间差异不显著。通过外源激素诱导试验发现,茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理均能诱导3个CAD基因的表达上调,但是三者各自的最大表达量随着激素种类的不同而存在差异,MeJA和SA诱导CAD1和CAD2基因的最大表达量要明显高于CAD3,而ABA诱导CAD1与CAD3基因的最大表达量均明显高于CAD2基因。
其他文献
脊椎动物的肌纤维在胚胎期形成,出生后数目不再改变。出生后肌肉的生长主要依赖卫星细胞的增殖分化而导致肌纤维长度增加和周径增大即肥大,而不是依赖肌细胞数目的增多即增生