论文部分内容阅读
甲基对硫磷(MP)是一种常用的有机磷农药,尤其在发展中国家大量用于作物的保护,但它对环境如水、空气和土壤具有毒害作用。因此,从土壤中筛选高活力的甲基对硫磷降解菌株,并从其中克隆表达有机磷水解酶基因以及构建高产有机磷水解酶重组菌,对解决甲基对硫磷等农药残留问题具有十分重要的意义。本研究从农药生产厂的废墟土壤中分离筛选到一株可降解甲基对硫磷的菌株,命名为MP-1。多相分类学研究表明菌株MP-1为一种革兰氏阴性、无孢子生成、杆状及具有运动性的细菌。依据16S rRNA基因序列的系统发育分析表明菌株MP-1属于伯克霍尔德氏菌属Burkholderia,与Burkholderia grimmiae R27T表现出最高的序列同源性为98.45%。此外,菌株MP-1的gyrB和recA与16S rRNA同源性较高的菌株的同源性分别低于89.03%和95.05%。菌株MP-1的G+C含量为62.6 mol%,主要的类异戊二烯醌成分为泛醌Q-8,主要的磷脂由磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、氨基脂(AL)和磷脂(PL)组成,脂肪酸主要为C18:1ω7c/C18:1ω6c等,与其它三株菌株的DDH值从24.6%到37.4%。根据表型和基因型特征,将菌株MP-1鉴定为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)的一个新种,命名为Burkholderia jiangsuensis sp.nov.MP-1T。菌株MP-1可代谢MP,并以MP为唯一碳源来生长。该菌株除了可以高效降解MP之外,还能降解乙基对氧磷(EP)、马拉硫磷、杀螟硫磷、敌敌畏、毒死蜱、甲胺磷、辛硫磷和二嗪磷等9种有机磷农药,对MP的降解速率高达173 ± 7 mg l-1h-1。从菌株MP-1中克隆得到甲基对硫磷水解酶基因Bjmprd,其所编码的酶BjMPH的氨基酸序列与来自Pseudomonassp.strain WBC-3 的 MPH 有三个氨基酸的差异,包括 Ser166,Val281,Ala301。酶BjMPH表现出较宽的底物谱,它催化MP的能力比MPH更强。通过对三个氨基酸定点突变及组合突变的研究,可知301位丙氨酸对酶活力的影响最大,它位于活性口袋里面,离催化中心p-metalion的距离为4.7A。基于多序列比对结果,对BjMPH进行了定点突变,结果表明突变体T98N对四种底物的催化专一性常数(kcat/Km),与母本相比均有较为明显的提高,其中对MP的催化效率提高4倍。