实验目的:疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最为严重的寄生原虫感染性疾病。世界上100多个国家为疟疾流行区，约22亿人口受到疟疾的威胁，每年有300~500万疟疾临床病例，病死人数高达110~270万。《世界疫苗与疫苗接种状况报告》指出，当今人类迫切需要针对艾滋病、结核和疟疾的疫苗。因此，研制开发有效的疟疾疫苗是当今人类亟待解决的重点课题。而疟原虫感染宿主机体应答的免疫学、分子生物学等综合基础研究是其必需的前提基础。 鼠疟研究已经证实，红内期保护性免疫应答需要CD4+T细胞和抗体的共同参与，Th1-Th2连续活化是确保保护性免疫效应发挥的关键。IFN-γ在Th1的建立和维持上发挥重要的作用，以往的文献显示Th1应答对抵抗鼠控制红内期疟原虫至关重要。IFN-γ作为具有重要免疫调节功能的Th1型细胞因子，可显著活化巨噬细胞等多种免疫细胞，而由巨噬细胞分泌的非特异性免疫效应分子NO在抗细菌等多种病原生物感染过程中介导了宿主的免疫防御作用。 CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)是天然存在的具有独特调节功能的细胞亚群。自1995年Sakaguchi等首次报道后即引起广泛关注。区别于传统的CD4+Thl/Th2细胞，Tregs特异地表达叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Forkhead box P3，Foxp3)和表面分子CD25，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4)和糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-induced tumor,GITR)。其中，Foxp3对Tregs的发育具有关键作用；CD25、CTLA-4和GITR分子与Tregs功能的发挥密切相关。体内、外试验均已显示，Tregs具有广泛的免疫抑制性。近期研究显示，消除Tregs能够保护小鼠免于致死型约氏疟原虫17XL株(Plasmodium yoelii17XL，P．yoelii 17XL)的攻击，这种保护性作用与特异性T细胞应答有关，提示Tregs在疟疾感染过程中发挥免疫抑制作用。 我们前期的研究发现，在P.yoelii 17XL感染早期，Tregs的参与可能是导致BALB/c小鼠未能建立有效的Tn1型细胞免疫应答的相关机制之一。与约氏疟原虫感染过程不同，BALB/c和DBA/2小鼠对致死型夏氏疟原虫AS株(Plasmodium chabaudi chabaudi AS，P.c.chabaudi AS)感染呈现截然相反的结局。因此，为充分了解Tregs在疟疾感染过程中的活化特点及与感染进程的相互关系，本实验以P.c.chabaudi AS分别感染BALB/c和DBA/2小鼠，以流式细胞术检测脾细胞悬液中Tregs百分含量；ELISA测定脾细胞培养上清IFN-γ和IL-4水平，以期探讨Tregs在疟疾感染中的调控作用。 实验材料与方法: BALB/c和DBA/2小鼠经腹腔感染1×106 P.c.chabaudi AS寄生的红细胞。制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。动态观察小鼠生存率。分别在感染前和感染后第1d、3d、5d、8d、10d、11d、12d和15d收集小鼠脾细胞，1x107/ml个细胞接种到24孔板，含10％小牛血清1640、5％CO2、37℃条件下培养48h后收集上清，待IFN-γ和IL-4检测。流式细胞仪专用染色管预先加入抗FeγⅢ/Ⅱ受体抗体2μl，取新鲜制备的1×107/ml脾细胞悬液0.1ml，再加入抗CD4-FITC单抗和抗CD25-PE单抗各0.2μg。以流式细胞术检测脾细胞悬液中Tregs百分含量。数据经t检验，P<0.05为差异显著。 实验结果: BALB/c小鼠原虫血症于感染后第8d达到峰值34.4％后迅速下降，于感染后第15d左右小鼠自愈；其IFN-γ水平和Tregs百分含量均在感染后第5d明显增加(P<0.05)，随后下降；IL-4水平在感染后第8d出现有意义的升高(P<0.05)，至感染后第10d达到峰值；DBA/2小鼠原虫血症于感染后第9～11d一直维持在峰值38％左右，并在感染后约第10d小鼠死亡；其IFN-γ水平在感染后第3d明显升高(P<0.01)，随后迅速回落；IL-4水平仅在感染后第5d出现有意义的升高(P<0.05)，Tregs百分含量在感染后的前8d平稳升高(P<0.01)，且于感染后第8～11d出现骤然上升(P<0.01)。 讨论: 鼠疟模型研究显示，不同小鼠对同种疟原虫株具有不同程度的抵抗和易感性。我们的研究发现，BALB/c和DBA/2小鼠分别对P.c.chabaudi AS感染产生抵抗和易感，表现出自愈和死亡两种不同的感染结局。BALB/c和DBA/2小鼠均能够建立以IFN-γ分泌增加为主的Th1型细胞免疫应答；随后，代表Th2型应答的IL-4分泌水平增加。在BALB/c小鼠体内Th1和Th2免疫应答的有效建立和连续活化是确保BALB/c小鼠存活的关键，而DBA/2小鼠Th1免疫应答过强同时Th2应答未能有效建立，导致小鼠最终死亡。由此可见，Th1和Th2细胞免疫应答模式的有效建立与活化确保了小鼠成功抵抗疟原虫的攻击，此过程与Tregs的活化时间和应答水平密切相关。 Tregs是机体维持正常免疫平衡和抑制自身免疫性疾病发生的重要效应细胞，对体内多种细胞的活化和增殖发挥抑制作用。Mendez S等曾报道，硕大利什曼原虫感染所致组织损伤的加重与局部组织中Tregs数量增多明显相关，Tregs与效应性T细胞之间的平衡紊乱是导致病情加重的主要因素，并且消除Tregs可阻止疾病的复发。本实验结果显示，DBA/2小鼠从对P.yoelii 17XL抵抗转变为对P.c.chabaudi AS易感的过程，伴随着体内Tregs数量的异常升高。并且，Tregs数量异常变化正是发生在Th1向Th2型应答过渡期。进而提示，Tregs在P.c.chabaudi AS感染过程中可能与疾病的严重性显著相关。 我们前期研究发现，在致死型约氏疟原虫感染早期，Tregs可能是导致BALB/c小鼠Th1型免疫应答无法成功建立的关键。本研究结果提示，Tregs可能在Th1向Th2转化过程中发挥免疫调控作用。确切机制有待进一步深入研究。 结论: 1、P.c.chabaudi AS感染过程中，易感小鼠BALB/c和抵抗小鼠DBA/2体内Th1和Th2型免疫应答模式存在明显差异。 2、Th1和Th2应答的有效建立和有序活化是确保抗疟保护性免疫效应发挥的关键。 3、Tregs在P.c.chabaudi AS感染中数量的异常变化和活化时间与疾病严重性密切相关。