研究背景:高血压病是心血管和脑血管疾病最为重要的危险因素之一[1]。全球高血压病患已超11亿,国内高血压患者数量亦有近3亿,加之国内对高血压的知晓率、控制率偏很低,我国面临的高血压防治任务极为严峻[2]。因此,进一步阐明高血压的致病机制、寻求潜在有效治疗靶点显得极为重要和迫切。高血压已被证实是基因与环境共同作用所导致的。大量研究证实,孕期不良刺激与高血压发生发展亦存在重要联系。英国学者David Barker[3]曾提出“健康与疾病的发育起源”学说,认为高血压病的根源可追溯至胚胎发育时期。孕期营养缺乏、免疫炎症、毒素暴露等均使胎儿暴露于一个非正常调控的生长环境中,导致子代出生质量降低,成年后高血压、冠心病、动脉硬化、糖尿病、代谢紊乱、肾功能不全等患病率增加,甚有学者将此列为心血管病发病的第三大因素。因此,从生命早期探索高血压发病机制具有重要意义。动物学实验亦证实:孕期受如免疫过度激活等不良刺激后,会导致子代高血压等心血管疾病发病率显著升高[4]。SD大鼠在孕期给予LPS腹腔注射暴露可较好复制孕期感染模型。母体孕期LPS暴露可经由胎盘-胎儿发生炎症反应,肿瘤坏死因子-α、白介素-1/6等炎症因子明显增高;过度的炎症反应干扰宫内胎儿的正常发育并可能发生异常的遗传学修饰,最终导致子代发生高血压等病态表型。然而,其涉及的机制尚不清楚。而另一严峻的现实是,超过60%的高血压患者有明确的家族史,提示了遗传因素在高血压的发生中起到了极为重要的作用。那么,本模型中由LPS暴露所致的子代大鼠高血压能否实现遗传,特别是跨代遗传呢?如实现了遗传,又是何机制介导了本模型高血压的遗传呢?近年来多个研究团队进行的大规模全基因组关联研究,以期找到调控血压的关键易感位点,但现有结果提示其在高血压遗传效应中所起作用远低于预期。提示对于高血压这一类多基因复杂性心血管疾病而言,通过传统方法寻找其遗传机制特别是跨代遗传机制收效甚微。而在表观遗传方面,目前心血管领域内的研究都仅限于表观遗传修饰在当代发病的作用,但还远未触及实质上的遗传、特别是跨代遗传的实现。而在其他疾病的跨代遗传机制研究主要集中在生殖类疾病、代谢性疾病等领域。Anne C.Ferguson-Smith,Qi Zhou等先后证实了精子DNA整体甲基化水平异常、精子ts RNA遗传可至后代出现能量代谢异常等表型[5-7]。那么心血管一类的多基因复杂类疾病又是如何实现遗传、特别是跨代遗传的呢?表观遗传学作为一种新兴研究领域,为进一步探索高血压的遗传机制提供了可能。机体、细胞能借由基因组重编程对环境产生差异性的应答。那么固定的DNA蓝本是如何灵活应对环境信号的改变呢?表观遗传学修饰在不改变DNA序列的情况下通过染色质重塑、组蛋白修饰、DNA甲基化和micro RNA等途径,实现对外界刺激的相对快速的应答[8]。目前已证实,营养不良、炎症刺激等外界不良刺激可导致机体产生过度氧化应激,进而诱发异常表观遗传修饰[9,10]。外源刺激持续作用致氧化和抗氧化系统失稳态,使得机体处于过度氧化应激状态,进而诱发下游靶基因的相关表观遗传学修饰[11]。在孕期LPS暴露的模型中,氧化应激异常增高是明确的;那么是否由于异常的氧化应激导致了相关靶分子发生异常表观修饰,进而诱发了高血压的跨代遗传呢?综上,我们提出假设:1、孕期LPS暴露能够导致子代大鼠尿钠代谢障碍、血压升高及其跨代遗传;2、孕期LPS暴露所致的子代高血压跨代遗传是由异常表观遗传修饰介导的。3、氧化应激水平的异常增高是孕期LPS暴露后异常表观遗传学修饰的触发因素。因此,本课题将重点探究孕期LPS暴露致子代大鼠高血压的分子机制、实现高血压跨代遗传的遗传机制,同时对表观遗传异常改变的上游触发因素进行探索。研究方法:1.观察孕期LPS暴露后各代大鼠血压、尿钠排泄情况通过袖尾法、植入子遥测法测量血压;以代谢笼检测大鼠24小时尿钠排泄情况。明确孕期LPS暴露能否导致子代大鼠高血压,子代高血压表型能否跨代遗传。2.寻找致子代大鼠高血压的关键分子、检测并验证其致高血压作用对肾脏组织完成m RNA测序。qRT-PCR和WB检测肾脏靶分子的信使核糖核酸（Messenger ribonucleic acid,m RNA）和蛋白的表达水平;利用靶分子的抑制剂,明确靶分子在致高血压及尿钠代谢障碍中的作用。3.检测靶分子外显子突变情况、启动子区甲基化情况,相关组蛋白修饰对靶分子表达的影响对肾脏组织进行靶分子基因的外显子区测序,明确有无突变;对靶基因启动子区进行甲基化测序,明确组间有无甲基化水平的差异。筛选组蛋白相关修饰明确表达是否存在差异,并进一步采用染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation）方法,明确组蛋白修饰在靶基因启动子区的沉积水平。进一步证实异常表观修饰在靶基因功能异常中的作用。4.检测LPS暴露后氧化应激水平;利用Tempol抗氧化处理、逆向证明氧化应激在表观遗传修饰中的作用检测LPS暴露MDA、SOD水平,检测LPS组和LPS+Tempol组H3K9me2-Rac1及下游分子变化等,了解异常表观修饰可能的触发因素。研究结果:1.孕期LPS暴露可以诱发子代大鼠血压升高和尿钠排泄障碍。进一步传代发现,孕期LPS暴露所致子代高血压表型可持续传递到F3代。在F4代中,尽管在基础状态下,组间血压未见明显差异;但组间在盐敏感性上存在明显差异,孕期LPS暴露组F4在高盐（8%HS）饮食诱导后,血压升高和尿钠排泄障碍情况明显高于对照组。2.m RNA测序筛选得到Rac1分子。Rac1的m RNA水平和蛋白表达在LPS组子代大鼠肾脏组织中显著高于对照组。F1代中LPS组子代鼠血清醛固酮含量未见明显差异但肾脏MR核转位及下游ENa Cs表达水平明显增高。Rac1特异性抑制剂NSC23766可使LPS组子代大鼠的血压上升、尿钠排泄障碍明显改善,MR入核及下游ENa Cs表达水平明显回降。3.孕期LPS暴露后,F1代肾脏组织Rac1基因的外显子区未见突变;Rac1启动子区甲基化水平检测亦未见明显差异。孕期LPS暴露后各子代的H3K9me2表达均显著降低、其在Rac1启动子区的沉积水平亦明显下降。孕期LPS暴露后,孕鼠和F1代子鼠的氧化应激水平显著增高;在应用Tempol后,F1代H3K9me2表达及其在Rac1启动子区的沉积水平均明显回升,Rac1-MR信号及血压情况均明显改善。4.H3K9me2的去甲基化转移酶KDM3b在F1代LPS组卵巢组织表达增高,而F2、F3未见明显变化。免疫荧光染色发现F1代LPS组卵细胞中KDM3b明显增高、H3K9me2降低。应用Tempol后F1代卵细胞的KDM3b和H3K9me2异常变化得到明显改善,同时F2代肾脏组织的H3K9me2表达及其在Rac1的沉积水平、血压均明显恢复。结论:孕期LPS暴露后使得各代肾脏H3K9me2表达及其在Rac1启动子区的沉积水平明显下降,并导致Rac1在各子代表达异常增高,并诱发下游MR入核增强、下游ENa Cs表达水平明显增高,水钠代谢障碍、钠水潴留,最终导致跨代遗传性高血压的发生。氧化应激是KDM3b功能异常及H3K9me2异常表观修饰的触发因素,而卵细胞是本模型高血压跨代传递的重要遗传介质。