Ii链是一种非多态性的Ⅱ型跨膜蛋白，其中一个重要功能是确保新合成的MHCⅡ分子的胞内转运。MHCⅡ-Ii复合体的内体分选信号已被证明为Ii链胞浆尾部的两个独立的亮氨酸基元，即Leu⁷/Ile⁸和Pro¹⁵/Met¹⁶/Leu¹⁷。鸡Ii链胞浆尾部含有Leu⁸/Ile⁹和Val¹⁷/Leu¹⁸两个基元，但基元周围氨基酸是否对内体定位功能发挥作用还未见报道。我们利用大引物PCR定点突变法，将鸡Ii链胞浆尾部两个基元及其基元周围氨基酸分别突变为丙氨酸（Ala），然后连接到pEGFP-C1载体中，构建一系列突变体。利用脂质体Lipofectamine^TM2000介导的转染方法，将突变体转染到COS-7细胞，荧光显微镜下观察GFP-Ii融合蛋白的定位情况。结果显示，两个基元可以独立调控Ii分子的内化；突变Glu³、Glu⁴、Gln⁵、Ile⁹、Ser¹⁰、Ser¹⁵、Gly¹⁶、Val¹⁷或Pro¹⁹时，融合蛋白均定位于细胞浆，Ii分子内化功能丧失；而突变Arg⁶、Asp⁷、Ser¹¹、Asp¹²、G1y¹³或Ser¹⁴时，融合蛋白均定位于细胞内体，Ii分子内化功能保持。结果表明，鸡Ii链胞浆尾部两个亮氨基酸基元具有独立地内体定位信号功能，同时，两个基元功能的正确发挥需要周围氨基酸特定的空间结构支持。各类动物Ii链的跨膜区是进化中最保守的部分。研究发现，跨膜区在Ii分子自身聚合成三聚体中发挥重要的作用，在缺乏胞外区的情况下，跨膜区可以使Ii有效聚合成三聚体状态。已证实人Ii链跨膜区Gln⁴7，Thr⁴9和Thr⁵0三个氨基酸对MHCII-Ii复合物的形成是必须的。我们应用大引物PCR突变法，将鸡Ii基因的Gln⁴7和Thr⁵⁰氨基酸突变，构建了C1-Q47A和C1-T50A重组质粒。同时，MHCⅡ分子的α链和β链被亚克隆到pEGFP-N1载体，构建了GFP-α、GFP-β重组质粒。我们将C1-Q47A或C1-T50A和GFP-α、GFP-β共转染COS-7细胞，利用Western blot和免疫共沉淀对鸡Ii链跨膜的功能进行初步探讨。结果表明，突变Ii链跨膜区Gln⁴⁷或Thr⁵⁰氨基酸后，MHCⅡ-Ii复合物的形成受限。Ii链可以应用于构建Ii-抗原表位嵌合体。一些研究者用Ii链序列作为基本的框架，将CLIP区用CD4+T细胞抗原表位基因序列替代，将该嵌合基因插入真核表达载体，构建的嵌合体中的抗原表位能够有效地呈递给T细胞。关于鸡Ii分子CLIP替代的DNA疫苗目前没有研究报道，我们利用3轮重叠PCR将鸡Ii基因的CLIP区去除，此时恰好形成了一个HindⅢ酶切位点，再通过常规PCR扩增NDV的F343抗原表位基因，该基因片段长33个氨基酸，两段带有HindⅢ酶切位点。将F343基因通过单酶切连接入Ii分子内，构建了C1-Ii-F343内源性靶向抗原表位嵌合体DNA疫苗。同时，构建了C1-F343非靶向DNA疫苗作为对照。30只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组，用内源性靶向DNA疫苗（C1-Ii-F343）和非靶向DNA疫苗（C1-F343）于股四头肌进行免疫,生理盐水、C1和C1-△CLIP作为研究对照。经过3次免疫后，取外周血对小鼠的体液免疫进行检测，免疫结果显示，只有C1-Ii-F343和C1-F343免疫组小鼠可以检测到针对F343抗原的特异性抗体，抗体滴度分别达到6400和1600，内源性靶向DNA疫苗组明显高于非靶向DNA疫苗组。构建抗原表位DNA替换鸡Ii分子的CLIP片段基因疫苗，为NDV的双靶向疫苗奠定实验基础。