新基因—代谢相关蛋白基因的克隆、功能研究及黄芪多糖对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞功能的影响

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第一部分人代谢相关蛋白的蛋白表达与功能的初步研究目的克隆和表达人代谢相关蛋白(MRP)基因,初步揭示MRP的功能。方法RT-PCR克隆MRP基因全长,将MRP基因构建到原核表达载体pPROEXHTa与真核表达载体pEGFP—C3,在E.col ROSSET(DE3)菌中高效表达并纯化MRP融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;利用激光共聚焦显微镜观察MRP在HEK293细胞中的定位。利用RT-PCR与Western Blot技术观察了MRP基因和蛋白表达谱,利用免疫荧光组化和激光共聚焦显微镜观察到MRP在胰岛细胞中的表达及定位。制备MRP Northern Blot探针。建立人脂肪细胞原代培养方法,利用RT-PCR技术观察不同浓度葡萄糖不同时间作用人脂肪细胞MRP的基因表达。结果成功制备特异性好、效价较高的多克隆抗体。激光共聚焦显微镜显示MRP定位于HEK293细胞的细胞浆及细胞核中。MRP表达广泛,其中在脂肪、肌肉、大脑中蛋白表达量较高,其他组织也有表达。免疫荧光组化和激光共聚焦显微镜显示MRP在胰岛β细胞中有表达,在α细胞中定位于细胞浆及细胞核中。成功制备MRP Northern Blot探针。葡萄糖影响人脂肪细胞MRP基因表达,葡萄糖作用时间增加,MRP表达呈现先增加后下降的趋势。结论我们克隆到了一个新的基因,广泛表达于人体的各个组织中。葡萄糖可以调控它在脂肪细胞中的表达。目的:以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察不同浓度黄芪多糖对其增殖和凋亡的影响,以及对胆固醇流出和ABCA1基因表达的影响。方法:将THP-1细胞诱导分化成泡沫细胞,用不同浓度黄芪多糖对其干预24小时,XTT法检测细胞增殖,Annexin V/PI染色、caspase3活性检测观察细胞凋亡情况。Y计数仪检测胆固醇流出,RT-PCR及流式细胞仪检测ABCA1的表达。结果:黄芪多糖呈剂量依赖性(10-100μg/ml)诱导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡,抑制增殖;促进胆固醇流出,增加ABCA1的表达。结论:黄芪多糖可影响THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡及增殖,通过增加ABCA1的表达而促进胆固醇流出。
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