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目的：探讨添加脑源性神经生长因子(brain—derired neurotrophic factorBDNF)、表皮生长因子(epidermal growth factor EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF)培养基联合人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithe-lialium,HRPE)细胞共培养对骨髓间充质细胞(bone marrow stromal cells.BMSCs)定向诱导分化的影响。
方法：实验分3组:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培养组、BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培养组,和对照组(单独BMSCs)。体外培养人视网膜色素上皮细胞(HRPE)和大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取第3代HRPE和第3代BMSCs接种于Transwell双层培养板内共培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,采用免疫细胞化学染色、RT—PCR检测角蛋白18、RPE65蛋白在诱导细胞中的表达。随后把诱导后细胞和人视网膜光感受器细胞再次共培养2d,第二天倒置相差显微镜下观察细胞吞噬现象,采用RT—PCR检测光感受器特异性标志视紫红质(Rhodopsin)在诱导细胞中的表达,单独培养诱导后细胞检测上清液中PEDF水平。
结果：共培养2 w后的细胞置倒置相差显微镜下观察:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培养组在诱导14 d后,BMSCs出现明显胞体由原来的纤维细胞外观变为圆形、椭圆形,胞浆内出现色素颗粒。出现类似RPE细胞样外观。而另外两组分化细胞明显较少,胞体基本没有变化,胞浆内也未见色素颗粒样改变；免疫细胞化学染色显示:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培养组能诱导BMSCs更多的表达角蛋白18(OD:0.527±0.029)、RPE65(OD:0.326±0.019)。将三种培养条件下所表达的阳性细胞分别进行统计学分析,组间差异有统计学意义(角蛋白18:t=38.611、37.532、P<0.05; RPE65:t=37.416、36.236、P<0.05)。RT—PCR的鉴定结果显示同样结果。对诱导后的细胞吞噬功能和分泌PEDF功能检测显示诱导后的可以吞噬感光细胞脱落的外节膜盘结构。单独培养诱导后的细胞上清液中可以检测到PEDF阳性。
结论：HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培养可以诱导BMSCs向视网膜色素上皮细胞分化。人BMSCs细胞在和HRPE共培养系统中加入适量浓度的EGF、BFGF、BDNF因子可以定向诱导人BMSCs发生类似RPE细胞样改变并表达RPE细胞的表面标志(角蛋白18、RPE65),并且具有能够吞噬视网膜光感受器细胞外界膜盘并且具有分泌PEDF功能。