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目的:乳腺癌(breast cancer,BC)是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,也是导致癌症死亡的第二大原因。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)约占所有乳腺癌的15-20%,它是一类快速增殖、高度侵袭的乳腺癌亚型,易早期出现复发和转移,预后较差。由于TNBC在分子水平具有高度异质性,不同分子亚型的患者的预后具有显著差异。目前,TNBC仍缺乏特异性的生物标志物及治疗靶点,因此个体化治疗的选择及临床疗效有限。深入探讨TNBC进展的分子基础,寻找有效的预后标志物,对于改善TNBC的治疗现状,降低复发转移风险,延长生存时间具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸,在结构上与mRNA相似,但又缺乏编码蛋白质功能的RNA。LncRNAs参与许多重要的生物学现象,如基因组印记、染色体构象形成以及酶活性的变构调节等。LncRNAs表达的特定模式可以协调细胞状态、分化和发育等。不断积累的证据显示lncRNA基因的过度表达、缺失或者突变与许多人类疾病密切相关。LncRNAs是一类重要的基因表达调控因子,可以通过与DNA、RNA或蛋白质的相互结合作用,在表观遗传、转录及转录后等多个层面调节靶基因的表达水平。例如,lncRNAs可作为促进转录的信号分子,或可作为抑制转录的诱导物,或可作为表观遗传的调控因子,亦或可作为支架与多种蛋白伴侣相互作用以形成核糖核蛋白。近年来,一系列异常表达的lncRNAs在不同类型的癌症中被广泛报道,它们可以通过多种机制参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等。此外,越来越多的研究发现lncRNAs在TNBC中发挥关键作用。因此,从lncRNAs中寻找新的靶点可能是治疗TNBC的一个有发展前景的治疗选择。我们前期研究利用生物信息学方法筛选与乳腺癌预后相关的lncRNAs,通过Kaplan Meier-plotter外部验证以及基于GEO乳腺癌数据的荟萃分析进一步确定lncRNA FOXD2-AS1可能与TNBC的预后密切相关。LncRNA FOXD2-AS1位于1p33号染色体上,转录本长度为2527bp。现有的研究结果显示,FOXD2-AS1在胃癌、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌及肝癌等中均表达上调,并能通过竞争性内源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)机制或转录调控机制促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药等。然而,目前关于FOXD2-AS1在乳腺癌中的表达变化及生物学功能尚无研究报道。本研究的第一部分着重探讨了FOXD2-AS1在TNBC细胞中的表达水平、生物学作用及其分子机制。预后评估对于选择合适的治疗方案至关重要。在常规的临床实践中,年龄、组织学分级及TNM分期等是预测TNBC患者预后的关键因素。然而,由于TNBC是一种高度异质性的疾病,即使是具有相同临床病理学特征的TNBC患者,对药物治疗的敏感性及其复发转移风险也存在很大差异,这表明目前传统的预后因素不足以对TNBC患者进行全面而精准的预后评估。近年来,随着高通量测序技术的不断进步,越来越多的基因和非编码RNA被证实可以作为癌症患者预后评估和治疗选择的生物标志物。此外,与单个分子相比,将多个分子整合到一起并建立一个多分子特征的预后模型,将会获得更好的预测价值。目前,关于TNBC复发转移风险的多个lncRNA分子特征预后模型鲜有研究报道。本研究的第二部分,利用生物信息学的方法建立并验证了一个基于5-lncRNA分子特征的新型预测工具,以预测TNBC患者术后的无复发生存(recurrence free survival,RFS)/无远处转移生存(distant metastasis free survival,DMFS)。材料与方法:第一部分:1.首先利用生物信息学方法筛选与乳腺癌预后相关的lncRNAs,再利用Kaplan-Meier Plotter进行外部验证进一步筛选;2.针对FOXD2-AS1已发表达研究进行荟萃分析,评估FOXD2-AS1的表达与恶性肿瘤患者的预后及临床病理学特征的关系;3.针对乳腺癌的GEO数据集进行荟萃分析,评估FOXD2-AS1的表达与乳腺癌患者的预后及临床病理学特征的关系,并利用Kaplan-Meier Plotter分析FOXD2-AS1对不同分子亚型乳腺癌患者RFS的影响;4.收集乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织标本,利用qRT-PCR检测FOXD2-AS1的相对表达,采用Spearman相关性分析计算FOXD2-AS1的表达与手术标本患者临床病理学参数的相关性;5.利用qRT-PCR检测FOXD2-AS1在正常乳腺细胞系和5种乳腺癌细胞系中的相对表达;6.利用RNA核浆分离和qRT-PCR检测FOXD2-AS1在TNBC细胞中的亚细胞定位;7.利用MTT方法和Transwell方法分别检测FOXD2-AS1对TNBC细胞增殖活力和迁移侵袭能力的影响;8.利用Western blot检测FOXD2-AS1对TNBC上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的影响;9.利用Starbase筛选可能与FOXD2-AS1存在结合位点的miRNA,并进行qRT-PCR验证;10.利用qRT-PCR检测miR-150-5p在乳腺癌癌与癌旁组织中的表达,分析与FOXD2-AS1表达的相关性;11.采用双荧光素酶报告基因实验及RNA免疫沉淀(RIP)分析验证FOXD2-AS1与miR-150-5p的吸附结合;12.利用Targetscan、miRDB和DIANA数据库筛选miR-150-5p下游的靶基因;13.利用qRT-PCR、Western blot及Transwell方法检测miR-150-5p/ZEB1轴对TNBC细胞迁移和侵袭的影响;14.利用qRT-PCR和Western方法检测在TNBC细胞中FOXD2-AS1表达对ZEB1的影响;15.TNBC细胞共转染miR-150-5p inhibitor和si-FOXD2-AS1后,利用Transwell、qRT-PCR及Western blot方法进行挽救实验,分析抑制miR-150-5p能否逆转敲减FOXD2-AS1对细胞迁移侵袭能力的抑制,以及ZEB1的表达下调;16.利用GSE58812数据集外部验证FOXD2-AS1与ZEB1表达水平的相关性;17.利用Genecards和PROMO数据库筛选FOXD2-AS1上游的转录因子;18.利用染色质免疫共沉降(CHIP)分析验证YY1与FOXD2-AS1启动子区的结合;19.利用qRT-PCR方法检测YY1对FOXD2-AS1的转录调控作用。第二部分:1.从GEO数据库中筛选符合条件的TNBC数据集GSE21653(训练集)和GSE58812(验证集),基于探针对基因表达谱数据进行重注释,获得lncRNA表达谱数据;2.通过单因素和多因素COX分析,1000次rbsurv降维分析,以及多因素回归分析,筛选与TNBC患者RFS/DMFS相关的lncRNA,并构建多个lncRNA的预后模型;3.基于风险评分公式对训练集和验证集中的样本进行评分,对风险得分进行ROC分析,评估预后模型的预测价值和稳定性;4.应用R软件包GSVA进行ssGSEA分析,计算每条KEGG通路得分与风险得分的相关性,推测预后模型可能涉及的生物学功能。结果:第一部分:1.FOXD2-AS1的表达与乳腺癌的RFS和DMFS均显著相关;2.FOXD2-AS1高表达与恶性肿瘤的不良预后及临床病理学特征(肿瘤大小、浸润深度、远处转移及TNM分期)相关;3.FOXD2-AS1高表达与乳腺癌的不良预后及临床病理特征(T分期、组织学分级及远处转移)相关,还与乳腺癌的三阴性分子亚型相关;4.高水平的FOXD2-AS1主要影响TNBC患者的RFS;5.FOXD2-AS1在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常乳腺组织,且FOXD2-AS1高表达与淋巴结转移显著相关;6.FOXD2-AS1在乳腺癌细胞中的表达显著高于正常乳腺细胞,且在TNBC细胞中的表达显著高于激素受体阳性乳腺癌细胞;7.FOXD2-AS1主要分布于TNBC细胞的细胞质中;8.FOXD2-AS1能够促进TNBC细胞的迁移和侵袭;9.FOXD2-AS1能够促进TNBC细胞发生EMT;10.经过筛选和验证得到能够与FOXD2-AS吸附结合的miRNA为miR-150-5p;11.miR-150-5p在乳腺癌组织中的表达显著低于与临近正常的乳腺组织,且与FOXD2-AS1的表达呈负相关;12.双荧光素酶报告基因实验及RNA免疫沉淀(RIP)分析结果证实FOXD2-AS1能够与miR-150-5p吸附结合;13.筛选出miR-150-5p调控的靶基因为ZEB1;14.miR-150-5p通过靶向ZEB1抑制TNBC细胞的迁移和侵袭;15.在TNBC细胞中FOXD2-AS1能促进ZEB1的表达;16.挽救实验结果表明抑制miR-150-5p能够部分逆转敲减FOXD2-AS1对TNBC细胞迁移和侵袭的抑制以及ZEB1表达的下调;17.GSE58812数据集外部验证表明在TNBC患者中FOXD2-AS1与ZEB1的表达呈正相关;18.利用数据库预测筛选出YY1可能是FOXD2-AS1上游的转录因子;19.CHIP分析表明在TNBC细胞中YY1能够结合FOXD2-AS1的启动子区;20.在TNBC细胞中YY1能够促进FOXD2-AS1的转录,使其表达上调。第二部分:1.针对训练集GSE21653,通过多重降维分析,最终筛选出5个与TNBC患者RFS相关的lncRNAs,并构建出5-lncRNA的预后模型;2.针对样本的风险得分在训练集中进行ROC分析,结果表明此5-lncRNA分子特征能够较好的预测TNBC患者的RFS;3.分层分析结果表明在大部分亚组中该5-lncRNA预后模型均显示出稳定的预测价值;4.KEGG通路分析结果显示,我们所构建的5-lncRNA分子特征涉及的生物学功能可能与三阴性乳腺癌中某些代谢通路及免疫通路相关;5.针对样本的风险得分在验证集中进行ROC分析,结果表明此5-lncRNA预后模型对于TNBC患者的DMFS同样具有稳定的预测价值。结论:1.FOXD2-AS1在三阴性乳腺癌的组织和细胞中高表达;2.在三阴性乳腺癌细胞中,FOXD2-AS1吸附miR-150-5p并抑制其功能,上调ZEB1的表达,促进细胞的侵袭转移;3.YY1通过诱导FOXD2-AS1的转录参与三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移;4.基于重注释后的lncRNAs表达谱数据,构建的5-lncRNA预后模型能够稳定预测三阴性乳腺癌患者术后的复发/转移风险,是三阴性乳腺癌的一个独立预后因素。