植物因其特有的生长发育模式而无法主动的规避不良环境因素,因此在个体生长发育的全过程中很容易受到环境因素的影响。在漫长的进化过程中,植物不仅成功的适应了多变甚至恶劣的生存环境,还进化出了一套高效调控基因表达的机制。其中表观遗传调控机制因其固有的快速灵活及可恢复性为植物快速调整或切换基因表达模式,并在第一时间内对环境改变做出反应提供了可能。在这一系列复杂的调控机制作用下,植物不仅成功地在多变的环境中生存下来,而且其个体发育具有极强的可塑性。从上个世纪90年代到本世纪初,胁迫环境下的植物分子遗传调控网络已得到了充分研究。与其它胁迫性环境因素不同(干旱,盐碱或高温等),冷胁迫下的分子遗传调控网络是非ABA依赖性的,其中ICE-CBF/DREB-COR (ICE: Inducer of CBF Expression; CBF/DREB:C-repeat Binding Factor/Dehydration Response Elements Binding protein; COR:Cold-regulated)级联通路是其主要组成部分。在此基础上,表观遗传学的研究结果不仅能进一步完善分子调控网络,并且能更好的解释基因表达调控的过程。近些年来,植物的表观遗传学研究获得了空前的关注。这些重要的研究结果不仅揭示了植物基因组如何在外界环境因素作用下行使功能,并为物种改良和育种提供了另一种可能的途径。这些研究主要包括三个方面的内容：组蛋白修饰(乙酰化,甲基化,磷酸化,泛素化及瓜氨酸化等),DNA甲基化(在植物中主要以CpG, CpHpG和CpHpH形式存在,其中H代表A,C或T)和RNA依赖性的表观遗传调控(与重复序列密切相关)。染色质不仅是遗传信息的载体,也是表观遗传调控机制行使功能的平台。根据结构的不同它可分为常染色质和异染色质以及兼性异染色质(在特定的个体发育阶段,由常染色质凝缩并丧失转录活性而转变成的异染色质)。本文以玉米(Zea mays L.)为研究对象,从常染色质上基因的表观遗传调控和异染色质转录激活两个方面分析了冷胁迫环境下的表观遗传调控过程。主要包括以下几个方面的工作：1.冷处理过程中全基因组表观遗传修饰的变化我们利用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测冷胁迫处理过程中全基因组组蛋白修饰含量的变化,并结合免疫染色技术(Immunostaining)分析组蛋白修饰在间期细胞核上的分布情况。Western blot结果显示,在冷胁迫处理过程中组蛋白乙酰化修饰(H3K9ac、H4K5ac和H44ac)含量逐渐降低,组蛋白H3K9me1修饰含量降低而H3K9me2修饰含量升高,组蛋白H3S10p修饰含量保持不变。Immunostaining结果显示,组蛋白乙酰化修饰主要分布在常染色质区域,组蛋白甲基化修饰和磷酸化修饰在全基因组均有分布,但在异染色质部位的分布密度明显高于常染色质部位。利用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)检测冷胁迫处理过程中全基因组DNA甲基化修饰的变化。结果显示,冷处理过程中全基因组m5C含量逐渐降低。此外,通过流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)检测冷胁迫处理过程中间期细胞核的构型,结果显示,冷处理导致G0/G1期和G2/M期分布峰的左移,这表明低温导致了全基因组水平的染色质凝缩。详细的染色质免疫沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-Seq)结果显示,与间期细胞核免疫染色结果相比,组蛋白乙酰化H3K9ac修饰并非限制性地分布于常染色质区域。虽然H3K9ac修饰主要分布在基因富集区域,但在重复序列区域(包括异染色质部位)也有分布。冷处理导致基因富集区域和多种重复序列(Gypsy, Copia和Centr等)区域组蛋白乙酰化H3K9ac修饰含量的降低,但值得注意的是,此过程中玉米主要重复序列成分Knob重复序列的H3K9ac修饰含量却显著升高。2.冷处理过程中常染色质基因的表观遗传调控我们利用荧光定量PCR (Quantitative Real Time PCR, QRT-PCR)技术分析冷处理过程中常染色质区域表观修饰酶和冷反应基因的表达模式,并结合化学遗传学策略,利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A (Trichostatin A, TSA)阻断组蛋白去乙酰化酶活性,检测在组蛋白去乙酰化酶功能性缺失的情况下,玉米冷反应级联通路ICE-CBF/DREB-COR的基因表达情况。结果显示,与对照组相比冷处理过程中玉米组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase, HDAC)和冷反应级联通路基因表达量上升,这表明低温能诱导玉米组蛋白去乙酰化酶和冷反应级联通路基因的表达。而在组蛋白去乙酰化酶功能性缺失的情况下,低温依然能诱导ZmICE1基因的转录,但不能激活ZmDREB1和ZmCOR413基因的表达。在此基础上我们进一步检测低温环境下,组蛋白去乙酰化酶功能性缺失时,玉米ZmDREB1和ZmCOR413基因的瞬时转录情况,结果显示,组蛋白去乙酰化酶功能的缺失通过抑制ZmDREB1基因的转录,进而阻碍了下游ZmCOR413基因的表达。上述结果表明,组蛋白去乙酰化酶在玉米冷反应过程中选择性地正调控着冷反应基因ZmDREB1.染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)和重亚硫酸盐测序(Bisulfite Sequencing, Bis-Seq)结果显示,冷处理过程中ZmDREB1基因启动子部位组蛋白修饰及DNA甲基化修饰呈现动态变化,ZmDREB1启动子部位的ICE1结合位点区域组蛋白乙酰化修饰(H3K9ac、H4K5ac和H44ac)逐渐升高,而组蛋白甲基化修饰(H3K9me2)和DNA甲基化修饰逐渐降低。与ICE1结合位点区域的表观遗传修饰相比,启动子PRBS (Putative Repressor Binding Site)区域组蛋白修饰和DNA甲基化修饰呈现相反的变化趋势。相比而言,在组蛋白去乙酰化酶功能性缺失玉米中,冷处理并未影响ICE1结合位点区域组蛋白修饰和DNA甲基化的修饰状态。但在启动子PRBS区域,组蛋白乙酰化修饰(H3K9ac、H4K5ac和H44ac)的含量明显增加,组蛋白甲基化修饰(H3K9me2)和DNA甲基化修饰的含量显著下降。此外,通过CHART-PCR (Chromatin Accessibility by Real-Time PCR)检测ZmDREB1启动子部位染色质凝缩状态,结果显示,冷处理过程中ICE1结合位点区域发生染色质脱浓缩,而PRBS区域染色质维持浓缩状态。组蛋白去乙酰化酶功能的缺失并未影响ICE1结合位点区域的染色质构型,却导致PRBS区域发生染色质重塑(Chromatin remodeling)。综合分析这些结果,我们认为组蛋白去乙酰化酶特异性作用于ZmDREB1启动子PRBS区域并通过影响染色质构型阻止转录抑制因子的结合从而调控ZmDREB1基因的表达。利用共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)和Pull down技术检测HDACs与异染色质蛋白HP1(Heterochromatin Protein1)间的相互作用,冷处理过程中表达量上调的6个玉米组蛋白脱乙酰化酶,在体外Co-IP实验中只有3个组蛋白脱乙酰化酶HDAC106、HDAC108和HDAC110能与异染色质蛋白HP1共沉淀。而在Pull-down检测中均未表现出与异染色质蛋白HP1的结合特性。这一结果说明,组蛋白脱乙酰化酶与异染色质蛋白HP1间不存在直接的相互作用,它们可能通过与其他功能蛋白相结合共同组成“染色质调节机器”蛋白质复合物共同行使功能。3.冷处理过程中异染色质的转录激活及表观遗传调控我们利用Northern印迹杂交(Northern blot)和QRT-PCR技术分析冷处理过程中Knob180-bp和TR-1串联重复序列的表达情况。结果显示,低温能激活Knob180-bp和TR-1的转录,但这种冷诱导的重复序列表达只分别持续了24小时(Knob180)和48小时(Knob TR-1),随即便恢复到基因沉默状态。ChIP和Bis-Seq结果显示,冷处理过程中Knob180-bp和TR-1重复单元H3K9ac和H3K9me2以及DNA甲基化发生协同变化,在冷处理初期,Knob180-bp和TR-1重复单元区域的H3K9ac修饰含量逐渐升高,随着冷处理时间的延长H3K9ac修饰含量逐渐恢复到对照组水平。而与对照组相比,H3K9me2和DNA甲基化修饰的含量在冷处理初期明显降低,随后恢复到对照组水平。CHART-PCR的检测结果表明,低温诱导的Knob180-bp和TR-1重复序列区域染色质脱浓缩分别在冷处理的前24小时和48小时。此外Southern blot和QRT-PCR结果显示,冷处理并未导致Knob180-bp和TR-1重复序列拷贝数的明显变化,其拷贝数分别维持在6×105和3×105左右。这一结果说明冷诱导的Knob转录激活并未导致大规模Knob重复序列的重组,而新转录出的Knob RNA可能通过RNA依赖性的表观遗传途径行使着功能。