鼠源性单抗在人体使用后可产生人抗鼠抗体(Human Anti-Mouse Antibody, HAMA)反应,而且分子量大,不能有效进入病灶部位,临床使用受到限制。单链抗体(single chain antibody, ScFv)是由一条连接肽将IgG分子的重链和轻链的可变区连接而成的,减少了免疫原性,分子小,实体组织穿透力强,血浆半衰期短,因而在临床疾病的诊断和治疗中具有重要的应用价值。应用TP-PCR方法构建抗人CD28单链抗体基因(抗CD28-ScFv)和pET32a- CD28 ScFv重组表达载体。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,抗CD28-ScFv在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白30%以上,表达产物以不溶性包涵体的形式存在。经过溶解包涵体,体外复性过程和镍柱亲和层析,纯化抗CD28-ScFv。应用流式细胞仪和MTT方法分别鉴定纯化的抗CD28-ScFv的免疫学活性及生物学功能。本研究改进了传统的蛋白复性条件,建立了稀释复性结合阶段梯度透析复性的方法,获得了比传统复性方法所获得的抗CD28-ScFv的特异性抗原结合活性更高的抗CD28-ScFv,同时也为别的蛋白复性提供了借鉴。在国内首次获得了具有免疫学活性的高纯度的抗CD28-ScFv,该基因工程单链抗体具有与外周血单个核细胞(PBMC)表面的CD28特异性结合的活性和刺激人外周血T细胞增殖的生物学活性,为抗CD28-ScFv的抗肿瘤药物的开发奠定了基础。