目的:Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophin,DMD)是以进行性、对称性近端肌肉无力及肌肉萎缩为主要临床特征,以肌肉纤维变性、坏死及纤维化为主要病理特征的X连锁隐性遗传性疾病。患者通常3-5岁隐袭起病,常于12岁出现不能行走,于20-30岁死于呼吸道感染和心力衰竭。尽管dystrophin蛋白缺失作为DMD的发病原因已十分明确,但导致肌肉变性、纤维化的具体机制尚不清楚。纤维化是一种细胞外基质(extracellular matrix,ECM)逐渐沉积、实质细胞逐渐减少的病理改变,可发生于多种不同的器官组织,纤维化的持续进展可致器官结构破坏、功能减退甚至衰竭。DMD患者肌纤维膜dystrophin蛋白缺失,细胞膜结构发生改变,完整性遭到破坏,当受到机械性刺激时,大量钠离子和钙离子内流。细胞内钠离子浓度升高,造成细胞水肿;而钙离子进入细胞内后,作为第二信使激活炎症进程的级联放大反应。同时,炎症细胞释放促纤维化因子,促进成纤维细胞增殖、分化为成肌纤维细胞(myofibroblast,MFb)。成纤维细胞和MFb分泌ECM及ECM重塑因子,导致ECM合成和降解失衡,出现纤维化。分泌型焦磷酸蛋白1(Secreted phosphoprotein 1,Spp1)是一种具有多种功能的分泌型酸性糖蛋白,又称骨桥素蛋白(osteopontin,OPN)。OPN作为一种重要的多功能糖蛋白,存在于细胞外基质中,由多种组织及细胞合成和分泌,可与纤连蛋白和胶原等基质分子结合影响细胞外基质重塑,在梗阻性肾病、心肌梗死、创伤修复等纤维化过程中均发挥了重要作用,但目前关于DMD中Spp1与肌纤维化关系的研究较少。Mdx小鼠因与人类具有相同的基因遗传学基础,被广泛应用于DMD的相关研究中。我们的实验主要关注于mdx小鼠骨骼肌中纤维化情况,研究纤维化相关基因在mdx小鼠不同时期的差异表达情况,以及Spp1基因在mdx小鼠及对照鼠中不同时期的表达量变化,进一步探讨在mdx小鼠中Spp1与肌纤维化的关系。方法:选取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,选取雄性C57BL/6Sc Sn小鼠为对照组,根据年龄分为2周组、4周组、8周组、12周组。每组选取6只,分别用于常规组织化学染色、基因芯片检测及q RT-PCR。以10%水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔注射麻醉,取小鼠股四头肌,分别进行包埋冰冻处理或直接冰冻处理。通过冰冻切片的常规染色(HE染色)及马松(masson)染色观察骨骼肌纤维化情况;使用基因芯片技术对mdx小鼠不同时期股四头肌进行基因表达谱分析,使用q RT-PCR技术检测不同时期mdx小鼠及对照鼠股四头肌Spp1基因表达情况,并应用spss13.0对数据进行分析。结果:1不同时期mdx小鼠肌肉纤维化情况H&E染色及马松染色显示mdx小鼠股四头肌纤维化情况:2周时肌纤维排列紧密,个别肌纤维出现变性,未见明显的肌再生,无结缔组织增生;4周时,出现肌肉变性坏死与再生,但肌纤维排列仍较紧密,无明显结缔组织增生;8周时,可见轻微的肌纤维排列疏松,部分小片状区域可见轻度结缔组织增生;12周时,结缔组织增生程度较8周稍加重,但仍为小片状区域的纤维化。(Fig.1、2)2 Mdx小鼠股四头肌基因芯片中与纤维化相关基因的表达情况选取mdx小鼠2周与12周股四头肌基因表达谱进行对比,取P≤0.05,fold-change值≥+2或≤-2为筛选条件,共筛选出差异表达基因2928个,通过Pathway通路分析筛选出与纤维化相关的基因,部分列于Table 1。其中Spp 1基因2周与12周相比fold-change值为-15.1354,变化明显。3 Spp1基因在mdx小鼠及对照鼠骨骼肌不同时期的表达3.1 Spp1在mdx小鼠股四头肌不同时期表达量比较:8周组较4周组明显升高,12周组较8周组表达量下降,但仍高于4周组,差异均具有统计学意义。3.2 Spp1在mdx小鼠股四头肌与对照鼠表达量比较:8周组与12周组Spp1表达量较同期对照组明显升高,具有统计学差异。3.3 Spp1在对照组股四头肌不同时期表达量比较:各组间均不具有统计学差异。(Fig.3)结论:1 Mdx小鼠早期(2周-4周)肌纤维化表现不明显,8周时骨骼肌内可见少量结缔组织增生,随后缓慢进展。2 Spp1基因在mdx小鼠成熟期(8周-12周)表达量明显增加,推测其在mdx小鼠肌纤维化中发挥一定作用。