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第一部分目的microRNA的筛选和let-7a在肺癌组织中的表达[目的]筛选非小细胞肺癌95D细胞株的目的microRNA.[方法]通过对CpG ODN刺激前后的非小细胞肺癌95D细胞株进行mi croRNA的基因芯片检测,筛选出变化幅度最大的microRNA.用Real-time PCR方法检测和验证目的microRNA在20例非小细胞肺癌患者肺癌组织和正常肺组织标本中的表达情况。[结果]经CpG ODN刺激后,绝大部分microRNAs表达水平出现下调,其中let-7a的下调幅度最大(达6.9倍)。70%肺癌组织标本(14/20例)中let-7a的表达低于正常肺组织,肺癌组织中let-7a的整体表达明显低于正常肺组织,仅为后者的60%,差异具有统计学意义。[结论]确定let-7a为非小细胞肺癌95D细胞株的目的microRNA,并进行下游实验。第二部分let-7a慢病毒载体的构建与鉴定[目的]构建let-7a慢病毒载体并进行鉴定。[方法]分别构建let-7a mimics和let-7a inhibitor慢病毒载体并包装。测定慢病毒滴度,并进行靶细胞侵染实验。[结果]慢病毒测序正确。当慢病毒滴度为1×108TU/ml时,侵染靶细胞(95D细胞)的效率可达到95%左右,符合实验要求。RT-PCR检测证实,转染let-7a mimics慢病毒载体的95D细胞表达高水平的let-7a,而转染let-7a inhibitor慢病毒载体的95D细胞表达低水平的let-7a,两者差异具有统计学意义。[结论]let-7a慢病毒载体构建成功。第三部分let-7a对非小细胞肺癌95D细胞株增殖和侵袭能力的影响及分子机制探讨[目的]观察let-7a对95D细胞增殖及侵袭能力的影响,并探讨可能的分子学机制。[方法]将95D细胞株分为let-7a过表达组(转染let-7a mimics慢病毒载体)和let-7a抑制组(转染let-7a inhibitor慢病毒载体)。通过细胞增殖实验和Transwell实验观察和比较let-7a(?)时上述两组细胞增殖与侵袭能力的影响。应用Real-time PCR及Western blot法分别检测和比较上述两组细胞在mRNA和蛋白水平表达KRAS和HMGA2基因的情况。[结果]let-7a过表达组的细胞增殖和侵袭能力明显低于let-7a抑制组,差异具有统计学意义。let-7a过表达组KRAS和IIMGA2在mRNA水平的表达明显高于let-7a抑制组,差异具有统计学意义。上述两种基因在蛋白水平的表达情况则表现为let-7a过表达组明显低于let-7a抑制组,差异具有统计学意义。[结论]let-7a能抑制95D细胞株的增殖与侵袭,其中部分重要的机制可能是通过调控KRAS mRNA和HMGA2 mRNA的转录后水平来抑制这两种基因的蛋白表达。