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研究目的肥胖是高血压、糖尿病、冠心病等多种慢性疾病的重要危险因素,不仅可导致多种代谢综合征,还可能引起呼吸功能低下及骨关节病,被世界卫生组织认定为影响健康的第五大危险因素,目前普遍认为高脂肪膳食以及低体力活动是导致肥胖发生的主要原因,但仍无法解释近年来全球肥胖及超重人口的急剧增加。研究发现有些内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)可能引起能量代谢紊乱从而促进或诱导肥胖的发生,被称为环境致肥因子(obesogens),其中邻苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexyl phthalate,DEHP)作为增塑剂广泛存在于生活环境中,且极易从母体中逸出进入大气、土壤、水体中污染环境,并经膳食饮水、呼吸、皮肤等途径进入人体,根据人群暴露评估研究显示,生活环境中可能存在DEHP长期低剂量暴露的风险。动物实验和人群调查研究证明DEHP具有生殖毒性、免疫毒性、胚胎毒性、神经毒性及致癌性等,作为环境致肥因子,DEHP暴露与肥胖、Ⅱ型糖尿病、血脂异常等代谢综合征密切相关,实验研究证明DEHP暴露可显著提高PPARγ在脂肪中的表达水平,并升高下游相关基因的表达,导致动物体重、脂肪组织增加,血清胆固醇、血糖水平升高,进而影响糖脂代谢并促进肥胖的发生。同样有研究发现DEHP暴露小鼠出现显著的摄食增多和日间平均体温降低,其能量代谢调控中枢器官下丘脑的关键神经肽表达紊乱,怀疑DEHP暴露可能通过干扰机体能量代谢稳态来诱导肥胖的发生。近年来国内外学者通过动物实验和流行病学研究探讨了 DEHP及其代谢产物与肥胖的关系,但研究结果尚未统一,且目前的动物实验采用的剂量大都是高于环境暴露浓度和每日耐受摄入量(tolerable daily intake,TDI)的,在实际生活环境中,人群的暴露是往往是长期低剂量且通过多种途径暴露的,并且高脂饮食和DEHP多是经口同时暴露的。因此本实验研究中,模拟人类的正常饮食和高脂饮食,经口暴露人体日常接触剂量的DEHP。探索长期低剂量DEHP暴露对小鼠代谢功能的影响,通过检测糖脂代谢等能量代谢指标,以及对肠道菌群和短链脂肪酸的影响,初步探索DEHP促进肥胖发生的机制,并观察在高脂饮食的条件下DEHP对肥胖是否存在促进作用,同时,我们将DEHP作用于体外培养的PPARy过表达NIH-3T3细胞,进一步观察了 PPARγ与脂肪发生的关系,以期为肥胖的有效干预提供基本数据,并且更好地评价DEHP对环境以及人群带来的影响,为其风险评估与风险管理提供科学依据,减少人群暴露的隐患。研究方法1.体内实验1.1实验动物分组和处理:48只8周龄(18～20g)雌性C57BL/6小鼠,随机分为对照组、0.05mg/kg.bw DEHP 组、HFD 组、HFD+0.05mg/kg.bw DEHP 组,每组12只。以玉米油为溶剂配制DEHP灌胃染毒,每周记录动物体重及食物消耗量,连续染毒28周后脱臼处死,眼球取血,并取脏器及脂肪组织称重。1.2葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验:分别于实验第16周末和28周末进行葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐受试验(insulin tolerance test,ITT),动物禁食6h后,尾静脉取血测血糖,记为0min血糖,随后动物经腹腔注射2 g/kg.bw葡萄糖或0.5u胰岛素/kg.bw,分别检测15、30、60、90、120 min时血糖值,绘制血糖变化曲线,并计算曲线下面积(area under the cure,AUC)。1.3能量代谢检测:每组取6只小鼠于25周时进行代谢笼的监测,记录小鼠24h内的代谢数据,包括呼吸交换率(RER)、氧气消耗量(VO2)、二氧化碳释放量(VCO2)和产热(Heat)。1.4体成分分析:各组小鼠在28周进行全身麻醉,通过XR-600型双能X线骨密度测量仪测定小鼠瘦体重(leanmass)和体脂(fat mass)。1.5形态学检测:小鼠脂肪组织和肝脏组织石蜡切片并进行HE染色,镜下观察细胞形态;细胞油红“O”染色、细胞免疫组织化学染色,显微镜观察并拍照记录。1.6 Western blot 检测:检测小鼠脂肪组织中 UCP1、OXPHOS、PPARγ、CDK5、p-PPARγ、Adiponectin、perilipin 的相对蛋白表达量。1.7肠道菌群及短链脂肪酸测定:采用16S rRNA扩增子测序检测小鼠粪便中肠道菌群丰度、多样性及优势菌群,通过靶向代谢物检测测定小鼠粪便中短链脂肪酸含量。2.体外实验2.1 NIH-3T3细胞的培养及实验处理:NIH-3T3(PPARγ2过表达)小鼠胚胎成纤维细胞分别给予终浓度为10μM、25μM、50μM、100μM的DEHP,空白组给予等体积的培养液,阳性对照组加入终浓度为0.1μM的Tg。2.2指标检测:加入受试物4d后,分别进行油红“O”染色、免疫组化染色;并提取细胞蛋白,采用Western blot检测细胞中PPARγ、CDK5、p-PPARγ蛋白的表达。结果1.体内实验1.1各组动物体重及食物消耗量变化:常规饲料喂饲下,DEHP暴露小鼠体重高于对照组,但无统计学差异(P>0.05)。高脂饲料联合0.05mg/kg.bw DEHP动物体重在第6周末明显高于高脂对照组(P<0.05),其后体重保持恒定增长,从第12周开始至实验结束体重持续呈增高趋势,与高脂对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。喂饲常规饲料两组动物中,DEHP暴露小鼠的食物消耗量和摄入总热量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。喂饲高脂饲料两组动物中,DEHP暴露组小鼠的食物利用率升高(P<0.01),摄食量和摄入总热量与高脂对照相比无统计学差异(P>0.05)。1.2各组动物体成分及脂肪含量变化:常规饲料喂饲情况下,DEHP暴露组动物瘦体重和脂肪含量与对照组相比升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。高脂饲料喂饲情况下DEHP暴露动物体脂与瘦体重均高于单纯高脂饲料喂饲组,差异有统计学意义(P<0.05)。喂饲常规饲料两组动物中,与对照组相比,DEHP暴露小鼠体内白色脂肪包括内脏脂肪/体重和皮下脂肪重量/体重比值增加,但差异无统计学意义(P<0.05)。高脂饲料喂饲情况下,DEHP组的内脏脂肪/体重和皮下脂肪/体重高于单纯高脂饲料喂饲组,差异有统计学意义(P<0.05)。DEHP暴露小鼠的棕色脂肪重量/体重在常规饲料和高脂饲料两种喂饲情况下,均呈现降低趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。在不同饮食条件下,DEHP染毒组小鼠的脂肪细胞体积明显增大,肝脏细胞可见明显脂滴空泡。1.3各组动物糖代谢变化:实验中期GTT结果显示,普通饲料组中DEHP暴露组在30min和60min时血糖值及AUC高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);高脂饲料组中,DEHP联合暴露组小鼠在15min、60min、90min和120min时血糖值及AUC均高于单纯高脂饲料喂饲组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验中期ITT结果显示,常规饲料喂养动物中,除60min时DEHP暴露组血糖明显高于对照组(P<0.05)外,其余时点和AUC均无统计学差异(P>0.05)。高脂饲料联合DEHP暴露组小鼠在60min、90min和120min时血糖值以及AUC均明显高于单纯高脂饲料喂饲组(P<0.05)。实验末期GTT结果显示,常规饲料组之间各时点血糖水平和AUC均无明显差异;高脂饲料组中,DEHP暴露和非暴露组各时点血糖变化差异明显增大,DEHP暴露组小鼠60min、90min和120min时血糖和AUC明显高于非暴露组(P<0.01)。实验末期ITT结果显示,常规饲料组之间各时点血糖水平和AUC均无明显差异。喂饲高脂饲料动物组中,DEHP暴露动物各时点的血糖变化、AUC均明显高于DEHP非暴露小鼠(P<0.01)。1.4各组动物能量代谢变化:常规饲料饮食组中DEHP暴露对RER无显著影响,但日间和夜间的二氧化碳释放量均减少,日间耗氧量与对照相比减少,差异有统计学意义(P<0.05),产热无显著性差异。高脂组中,DEHP染毒组的RER、二氧化碳释放量、耗氧量以及产热均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。1.5动物脂肪组织中PPARγ及能量代谢相关蛋白表达变化:常规饲料组中DEHP暴露组与对照组相比PPARγ蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),高脂组PPARγ蛋白表达与单纯高脂组相比无统计学差异(P>0.05)。在不同饮食条件下DEHP暴露均可升高p-PPARγ(Ser273)蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。在两种饮食条件下,DEHP暴露组Adiponectin蛋白表达减少(P<0.05)。在常规饲料饮食组中,DEHP染毒组perilipin蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),而在高脂组中有降低的趋势,但无统计学差异(P>0.05)。1.6各组动物的肠道菌群及短链脂肪酸变化:DEHP和均高脂饮食可降低小鼠肠道菌群丰度和多样性,降低肠道菌群中优势菌群的数量,DEHP联合高脂饮食组的F/B值与高脂对照相比显著升高(P<0.05)。高脂饮食及DEHP暴露都可使除丙酸外的SCFA含量明显降低,包括乙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸,其中丁酸降低最明显。2.体外实验结果2.1不同剂量DEHP对细胞脂滴生成的影响:与对照组相比,DEHP组脂肪滴数量增多且呈剂量依赖性。2.2不同剂量DEHP对细胞脂肪内Perilipin表达影响:在不同剂量DEHP组中Perilipin表达增加,其中100μm/L剂量组表达增加最明显。2.3不同剂量DEHP对细胞PPARγ、p-PPARγ(Ser273)、CDK5表达的影响:不同剂量 DEHP 对细胞 PPARγ、p-PPARγ(Ser273)、CDK5 表达的影响:Western blot显示,不同剂量DEHP染毒组的细胞的PPARγ在各组表达差异不明显(P>0.05),但p-PPARγ表达明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01);同时CDK5蛋白表达与对照相比有增多的趋势。结论1.DEHP长期低剂量暴露在普通饮食条件下可引起脂肪组织中PPARγ及下游相关蛋白表达紊乱;体外细胞实验显示DEHP促进了 NIH-3T3(PPARγ2过表达)细胞的成脂分化并影响PPARy及下游相关蛋白的表达。2.高脂饲料联合DEHP长期低剂量暴露促进动物体重增加和脂肪蓄积,引起动物糖脂代谢异常和能量代谢率的降低。3.高脂饲料联合DEHP暴露改变了动物肠道菌群的丰度和多样性及优势菌群的比例,使除丙酸外的SCFA含量明显降低。