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端粒是染色体末端的DNA串联重复序列和端粒结合蛋白组成的复合体,能够防止染色体末端的降解、融合和重排,从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。由于在DNA复制过程中,DNA聚合酶无法完整的复制滞后链DNA,在通常的DNA复制中染色体末端会发生序列丢失(即末端复制问题),因此在正常的细胞衰老过程中,伴随着细胞分裂次数增多,DNA多次复制,染色体末端的端粒最终会逐渐缩短。当端粒逐渐缩短,端粒维持染色体的稳定功能受到破坏,细胞将会出现衰老的表现;而当端粒持续性缩短直至长度不足3 kb时,大量细胞将会走向死亡,机体则表现为衰老或早衰,在此时极少数的细胞端粒酶活性被激活,转化为无限增殖的癌细胞。由于端粒的长度存在高度的异质性,不同染色体的端粒缩短程度是不一样的,而在整体水平分析大量端粒长度其结果也是所有端粒长度的平均值,无法揭示少量的非常短的端粒的存在,而正是这些短端粒的存在才是触发衰老和癌变的关键;此外,在不同物种之间端粒长度存在很大的差异,人类端粒长度(0.5-18 kb)远小于实验室常用动物模型(25-150kb),因此,亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。目前端粒长度主要分析方法是末端限制片段分析法(terminal restriction fragment,TRF)、定量 PCR(quantitative PCR,qPCR)、STELA(single telomere length analysis)、Q-FISH(quantitative fluorescence in situ hybridization)和Flow-FISH,但是还没有一种方法能够快速、准确地检测群体中关键的短端粒的长度和比率。本论文拟用实验室自行研发的超高灵敏流式检测装置,依赖于其高灵敏、多参数的检测性能,建立一种单个染色体水平的端粒长度的检测方法,并将该方法推广至临床样品的研究中。本论文主要包括以下内容:第一章主要对端粒的结构和功能,端粒与人类多种疾病的关系进行介绍,并简介现有的端粒长度分析方法和超高灵敏流式检测技术(high sensitivity flow cytometry,HSFCM)。本章的最后简要介绍了本论文的选题思路以及研究内容。第二章为单颗粒水平染色体检测的超高灵敏流式分析方法的建立。我们以实验室常用永生细胞作为实验对象,通过优化提取过程中的各种条件,建立一种简单易行、普适性强、质量高的染色体悬液制备方法;并结合核酸染料PI和Picogreen对染色体进行标记,利用HSFCM实现了单个染色体的流式核型分析(利用流式细胞仪分析染色体的数目和大小);通过利用荧光显微镜对所提取HeLa细胞的染色体的结构直接进行观察;结合流式核型分析结果中荧光峰的中位值和相应染色体DNA含量的线性关系,采用Matlab软件对HeLa细胞的染色体流式核型分析数据进行理论模拟。结合这三种手段,验证所制备染色体悬液的纯度以及染色体的结构完整性。第三章为端粒长度的单染色体水平HSFCM测定方法的建立。采用所设计能特异识别端粒重复序列的肽核酸探针,通过对杂交条件的优化,建立在悬液中对染色体的端粒进行荧光原位杂交的方法。,采用HSFCM对单个染色体的散射和绿色荧光信号进行检测,结合AlexaFluor488当量已知的荧光标准球所绘制的荧光强度和AlexaFluor488当量的标准工作曲线,将单个染色体端粒的荧光信号强度转换为单个染色体的端粒长度,实现端粒长度的单染色体水平测定。第四章为端粒长度检测的HSFCM与传统分析方法的对比。我们选择五种永生细胞系(HeLa、A549、HEK293T、SMMC-7721 和 Hep G2)作为实验对象,分别进行HSFCM和三种主要的传统分析方法(TRF、qPCR和Q-FISH),并将四种分析方法的性能进行对比,从而验证我们所发展的在单染色体水平测定人类染色体端粒长度的HSFCM方法的准确性和可靠性。第五章为临床急性和慢性髓系白血病患者外周血样本的单染色体水平端粒长度测定。通过优化外周血单核细胞的提取和体外培养的条件,我们实现了对外周血中淋巴细胞的体外培养,并将所建立的HSFCM方法应用于临床外周血淋巴细胞端粒长度的检测。通过对比健康人和白血病不同阶段患者的短端粒含量,考察其是否能用于疾病治疗效果的评估;通过对比急性白血病和慢性粒细胞白血病加速或急变期患者的短端粒含量,考察短端粒是否能作为疾病急变的一个指标。第六章为特异染色体端粒长度的单染色体水平测定。我们搭建了配备有488 nm和642 nm两个激光器的超高灵敏流式检测装置,利用分别靶向端粒重复序列和特异(X和18号染色体的α-卫星DNA序列)染色体的两种肽核酸探针,实现了对特异染色体的指认及其端粒长度的同时分析,对比了X和18号染色体之间的端粒长度差异。我们还发现HeLa细胞中存在X染色体的亲本同系物(即拥有相同的α-卫星DNA序列但拷贝数不同的两种X染色体)。第七章对本论文的研究工作进行总结,并在此基础上对将来的进一步研究思路和方向进行展望。