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鳞翅目昆虫是威胁农业生产的最大害虫类群,为减少其对农业生产的危害,人们每年使用大量化学农药以控制害虫数量。但化学农药的滥用,不但对环境造成污染,威胁人们的健康,而且在消灭害虫的同时也对非靶标生物产生了不良影响。
鳞翅目昆虫翅面具有色彩斑斓的图案,其翅面的鳞毛是鳞翅目昆虫区别于其它生物的典型特征,也是鳞翅目昆虫伪装和拟态的主要构成要件。鳞毛由表皮的毛原细胞形成,是一种具有精细结构的表皮衍生物。鳞毛具有调节温度的功能,增加了虫体对环境温度的适应性。鳞毛精密结构与光线相互作用,从而产生了结构色,人们对结构色的产生机理做了大量研究,但其机理仍然有待研究。
家蚕(Bombyx mori)具有详尽的基因组数据信息,是鳞翅目昆虫研究的模式生物。因此,本论文从分子生物学的角度着手,以家蚕(Bombyx mori)成虫鳞毛为研究对象,利用家蚕基因组数据库、EST数据库和表达芯片数据库,采用SDS抽提和胰蛋白酶直接消化相结合的蛋白提取方法,利用LC-MS/MS调查了家蚕鳞毛的蛋白质构成。另外,采用RNAi技术,研究了部分表皮蛋白基因对家蚕鳞毛表型的影响,获得以下主要结果:
1.家蚕鳞毛的蛋白质构成
本研究采用SDS抽提和胰蛋白酶直接消化相结合的方法,提取家蚕(Bombyxmori)成虫鳞毛蛋白质,并利用LC-MS/MS对所获得的肽段进行了鉴定,进而将在鳞毛中发现的175个肽段与基于由silkDB、家蚕cDNA数据库以及NCBI构建的本地数据库进行比对,总共鉴定获得40个蛋白。其中包括7个不可溶性表皮蛋白,它们是通过使用胰蛋白酶直接消化SDS抽提后剩余的沉淀所获得的,首次在鳞毛中发现表皮蛋白。这些表皮蛋白中有一半以上是属于BmCPG蛋白家族。而在SDS抽提的蛋白中,发现31个非表皮蛋白,他们分属于9类蛋白质:(1)肌肉蛋白,(2)蛋白酶与抑制剂,(3)转运蛋白,(4)新陈代谢与糖代谢相关蛋白,(5)蛋白分泌相关蛋白,(6)热激蛋白,(7)氧化还原相关蛋白,(8)储存蛋白,(9)其它类的蛋白质。
2.家蚕鳞毛表皮蛋白基因的功能
为进一步研究部分家蚕表皮蛋白基因对家蚕鳞毛和鳞片臼表型的影响,我们在蛹期对家蚕蛹注射siRNA,通过RNA干涉研究家蚕鳞毛表皮蛋白基因的功能。结果表明,注射了siRNA的家蚕羽化后,在表型上未能发现明显差异。采用实时定量PCR检测了RNAi后家蚕四个表皮蛋白基因BmCPG1、BmCPR2、BmCPR63、BmCPG11的表达水平,结果与对照(注射EGFPsiRNA)相比均有不同程度的下降,这表明所注射siRNA干扰了家蚕表皮蛋白基因的正常表达。随后我们用扫描电子显微镜(SEM)观察了RNAi后家蚕鳞毛及鳞片臼的表型变化,结果表明,与对照组鳞毛相比,RNAi后家蚕鳞毛的脊脉宽度和间距都有减小的趋势,同时鳞片臼的密度和直径也有减小的趋势。我们推测家蚕鳞毛表皮蛋白基因表达量的降低导致表皮蛋白的合成减少,进而使得毛原细胞没有足够的材料来完成鳞毛的构建。特别是在不同干涉组的鳞毛中均观察到鳞毛表面的脊脉出现了大量的分叉与交叉,形成麻花状或串珠状脊脉,这也可能是表皮蛋白基因被干涉后,毛原细胞无法及时调整其鳞毛发育过程而出现的一种发育紊乱。
本研究首次从鳞毛中鉴定出了40个蛋白质,其中包括7个表皮蛋白,并对家蚕蛹期BmCPG1、BmCPR2,BmCPR63、BmCPG11四个表皮蛋白基因进行RNAi以研究这些基因对鳞毛表型的影响。我们推测,表皮蛋白是家蚕鳞毛的重要组成成分,对鳞毛发育和功能的完整性起到重要的作用,是鳞毛构建其精密结构的关键蛋白质。