斑蝥酸钠对人胃癌及食管癌细胞作用的体外实验研究

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研究目的: (1)观察不同浓度的斑蝥酸钠对人胃癌细胞株BGC823和人食管癌细胞株Eca109生长的影响; (2)研究斑蝥酸钠对细胞周期及细胞凋亡的影响; (3)研究斑蝥酸钠对凋亡相关基因Bcl-2、P53表达的影响。 研究方法: (1)细胞培养 人胃癌细胞株BGC823由南京中医药大学伤寒教研室惠赠;人食管癌细胞株Eca109购于上海细胞所。将细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃,含5%CO2的培养箱中孵育,长满后用0.25%胰酶消化传代。 (2)细胞增殖抑制实验 采用MTT法,取处于指数生长期的人胃癌细胞株BGC823和人食管癌细胞株Eca109,加入适量0.25%胰酶消化,用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液配成悬液,用血球细胞板计数,并以RPMI1640全成分培养液稀释两种细胞悬液,各配成2×105/ml,取96孔细胞板,每孔加细胞悬液180μl。将药液20μl分别加入各孔细胞悬液中,每个剂量重复4孔。将含人胃癌细胞株BGC823、人食管癌细胞株Eca109的细胞板在37℃,含5%CO2的培养箱中分别孵育8h、12h、24h、48h、72h后取出细胞培养板,MTT用无血清RPMI1640培养液配成1mg/ml溶液,每孔加100μl,37℃温育4h,使MTT还原为formazan,吸出上清液,加入100μlDMSO使formazan溶解,混悬仪混匀后用酶标仪在490nm处测定每孔光密度(A)。计算抑制率(%)=(1-实验组A/对照组A)x100%。 (3)形态学观察 用不同浓度的斑蝥酸钠处理人胃癌细胞株BGC823和人食管癌细胞株Eca109后,在倒置显微镜下观察用药组细胞形态变化,并摄影。 (4)细胞周期和细胞凋亡测定 取处于指数生长期的人胃癌细胞株BGC823加药培养12h、24h后,人食管癌细胞株Eca109加药培养24h后,用适量0.02%EDTA进行消化,制成单细胞悬液,1000r/min离心,PBS洗涤2次,配成1×106/ml细胞悬液,75%冷乙醇-20℃固定,上机测定前,离心去乙醇,用PBS洗涤2次,用0.5mlPBS悬浮细胞制成细胞悬液,加入PI染液0.5ml,4℃避光染色30分钟以上,经300目尼龙网过滤后,上流式细胞仪检测凋亡细胞的含量,并观察分析
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