烟草根黑腐病(Tobacco black root rot disease)是由根串珠霉(Thielaviopsis basicola)引起的严重危害世界烟草生产的真菌病害。T. basicola广泛分布在世界的主要产烟区,危害大且难以防治。病残体和带菌土壤是该病的初侵染源。条件适宜时分生孢子或厚亘孢子萌发产生侵入丝由伤口侵入寄主表皮细胞,侵入后菌丝在表皮细胞间分枝蔓延,形成大量分生孢子和厚垣孢子,进行再侵染。由于目前缺乏特效的药剂和抗性品种,烟草根黑腐病的病后治理难度相当大,因此,对土壤中的烟草根黑腐病菌进行定量检测,在分生孢子大量滋生以前采取有效措施加以控制对防治该病害至关重要。传统上烟草根黑腐病菌的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。本研究即运用PCR技术,建立了土壤中T. basicola的常规PCR和实时定量PCR(real -time quantitative PCR,以下简称qPCR)检测体系。论文主要研究结果如下:①建立了烟草根黑腐病菌的常规PCR检测体系。在T. basicola的rDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)设计了一对特异引物Tb5/Tb6,对PCR反应条件进行优化,建立了常规PCR检测体系,扩增片段为338 bp。该检测体系特异性强、灵敏度高,其基因组DNA检测灵敏度可以达到1 pg/μL,土壤中分生孢子检测灵敏度为10个,可用于土壤中T. basicola的检测。②建立了土壤中烟草根黑腐病菌的SYBR Green?ⅠPCR检测体系。运用上述的特异性引物对Tb5/Tb6建立了SYBR Green? I PCR检测体系,以10倍浓度梯度稀释的T. basicola基因组DNA为模板进行扩增,其基因组DNA检测灵敏度达100 fg/μL。以接种不同浓度病菌分生孢子的土壤DNA为模板进行灵敏度检测,土壤中分生孢子检测灵敏度为0.4个,每个反应体系中的分生孢子数目的对数和对应的PCR循环数的相关性系数为0.95(P<0.05)。与常规PCR相比,SYBR Green?ⅠPCR对根黑腐病菌的检测灵敏度提高了10倍,对土壤中分生孢子的检测灵敏度提高了25倍。③建立了土壤中烟草根黑腐病菌的TaqMan PCR检测体系。利用引物探针设计软件Beacon designer设计了特异性引物对TbF/TbR及TaqMan探针TbP,建立了TaqMan探针实时定量PCR检测体系,扩增片段为76 bp。以10倍浓度梯度稀释的T. basicola基因组DNA为模板进行扩增,其基因组DNA检测灵敏度达100 fg/μL。以接种不同浓度病菌分生孢子的土壤DNA为模板进行灵敏度检测,土壤中分生孢子检测灵敏度为0.3个,每个反应体系中的分生孢子数目的对数和对应的PCR循环数的相关性系数为0.98(P<0.05)。与常规PCR相比,TaqMan探针实时定量PCR检测体系对根黑腐病菌的检测灵敏度提高了10倍,对土壤中分生孢子的检测灵敏度提高了33倍。本研究建立的SYBR Green?Ⅰ和TaqMan探针实时定量PCR检测体系可以准确地定量检测土壤中的T. basicola,对田间病害发生情况进行动态监测,实现了田间病害的早期诊断,为烟草根黑腐病的防治提供理论依据。