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猪圆环病毒2型(PCV2)是引起世界养猪国家经济损失的重要病原之一。PCV2感染与临床多种综合征疾病有关,这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)或猪圆环病毒病(PCVD)。 PCV2是一个无囊膜单股环状DNA病毒,PCV2基因组上有4个开放性阅读框ORF1～4,其中ORF1～3编码病毒非结构蛋白,ORF2编码病毒结构蛋白,即Cap蛋白。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,在抗病毒感染免疫中发挥着重要作用。本研究以纯化的PCV2病毒粒子为免疫原,成功筛选出针对PCV2Cap蛋白单克隆抗体,并利用其中的一株单抗和制备的兔多抗血清建立了检测PCV2的夹心ELISA抗原检测方法,为PCV2诊断和病毒蛋白功能研究提供了重要工具。本研究的具体内容如下：1.PCV2单克隆抗体的制备与鉴定本研究利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫Balb/c小鼠,通过单克隆抗体技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、3E6和5A6。体外培养连续传代至第20代,分泌抗体的效价基本一致。3E5、3E6和5A6培养的上清效价分别为1：12800、1：1600和1：6400,腹水效价为1：6400000、1：640000和1：800000；3株单抗亚类与型鉴定,重链均为IgG2a亚类,轻链为κ型；间接免疫荧光试验结果显示,3株单抗均可与PCV2产生特异性荧光反应；病毒中和试验显示,3E5和3E6均具有良好的中和活性,而5A6不具有中和活性；Western blot结果表明,3株单抗均可与PCV2Cap蛋白(约30kDa)发生特异性反应,其识别的表位需要Cap蛋白N端42～50aa区域某些氨基酸的参与。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。2.PCV2夹心ELISA抗原检测方法的建立与初步应用本研究利用PCV2单克隆抗体3E5作为捕获抗体,兔抗PCV2血清为第一抗体,成功建立了PCV2夹心ELISA抗原检测方法,其优化的反应条件为：单抗包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h；用含5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液封闭,37℃作用1h；待检抗原稀释度应在1：2以上,37℃作用2h；兔抗PCV2血清1：8000稀释,37℃作用1h；羊抗兔IgG-HRP稀释度1：10000,37℃作用0.5h; TMB显色时间为37℃作用10min。判定标准为：样品的OD450nm值≥0.209时为阳性,样品OD450nm值<0.191时为阴性,介于0.191～4).209之间为可疑。该ELISA方法与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪巨细胞病毒(PCMV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)及副猪嗜血杆菌(Hps)等均无交叉反应性。检测PCV2细胞毒,其最低检测下限为10259TCID50/mL;批内和批间试验显示其变异系数均小于10%,说明该ELISA方法具有较高特异性、敏感性和重复性。采用倍比稀释PCV2标准样品绘制病毒抗原定量检测的标准曲线,检测范围为390.6～25000TCID50/mL,相关系数r为0.99。应用该方法定量检测6份细胞毒样品中PCV2含量,结果与间接免疫荧光法测得的病毒TCID50相似；该方法与经β-丙内酯灭活的PCV2细胞毒、真核表达的PCV2Cap蛋白均可有效反应,但不能与甲醛灭活的PCV2抗原反应。用该方法检测临床发病猪淋巴结组织样品中PCV2含量,发现仔猪表现PMWS的临床症状与其组织中PCV2的病毒含量有明显的正相关性。以上结果表明该方法在应用于PCV2含量检测和PCVAD诊断方面,具有重要应用前景。综上所述,本文筛选到单克隆抗体与PCV2反应性良好,可以应用于Western blot、IFA和病毒中和试验中作为PCV2抗原的诊断试剂。建立的检测PCV2的夹心ELISA抗原检测方法,具有较好的特异性、敏感性、重复性。这些抗体的制备和ELISA方法的建立为今后PCVAD的诊断和流行病学调查提供了有用方法。