论文部分内容阅读
创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)是指由外部因素作用于头部导致的中枢神经系统缺损性疾病,具有高发病率、高致死率和高致残率等特点,给社会和家庭带来沉重负担,寻找积极有效的治疗方法是目前亟待解决的问题。干细胞替代疗法给TBI治疗提供了新的策略和希望,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)来源于人脐带沃顿胶组织,具有无伦理学争议,来源广泛,多向分化潜能、低免疫原性等特点,是组织工程良好的种子细胞。然而移植后成活率低、数量不足等问题仍然制约着干细胞移植的应用。因此,创造适合移植干细胞生长与存活的微环境对于提高干细胞生物学活性和治疗效果至关重要。藻酸盐(sodium alginate,SA)水凝胶组织工程支架具有三维网络结构,与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)具有天然相似性,可为细胞生长提供立体支撑,且为细胞的气体交换、营养输送及其新陈代谢产物的排出提供良好的传输通道。透明质酸(hyaluronan,HA)作为天然细胞外基质的主要成分之一,可与干细胞表面特异性受体结合,促进干细胞的增殖、粘附、帮助信号传导,调控细胞分化。因此,本课题通过构建SA/HA组织工程支架,联合hUC-MSCs研究对创伤性脑损伤的治疗作用。目的本实验利用组织工程技术体外构建SA/HA复合功能支架,并对其物化性能等进行表征,对包载hUC-MSCs的SA/HA水凝胶支架进行生物学评价,以创造更适合hUC-MSCs生存的微环境;在体内实验中,探究hUC-MSCs联合SA/HA水凝胶支架对TBI大鼠的神经修复作用及其可能的作用机制,以期为干细胞移植治疗TBI提供新的策略和方法。方法1体外实验研究SA/HA水凝胶支架与hUC-MSCs相容性评价通过内部凝胶法制备4组不同配比的藻酸盐水凝胶,分别为1%-0.8、1%-0.5、0.5%-0.5、0.5%-0.2;扫描电子显微镜(SEM)进行水凝胶形貌表征;试管倾斜法检测不同配比的凝胶时间;冷冻干燥及称重法测定不同配比的含水率及降解性能;流变仪检测不同配比的弹性模量;流式细胞仪检测hUC-MSCs的表面标记物;通过添加一定比例的透明质酸,SA与HA浓度比分别为4:1 (S4H1)、2:1(S2H1),构建不同配比SA/HA水凝胶支架,包载hUC-MSCs,共分三组,分别为单独SA组、S4H1组、S2H1组;通过激光共聚焦显微镜观察hUC-MSCs在水凝胶中三维分布;Live-Dead染色法检测干细胞在不同分组中的存活;CCK-8检测不同分组中干细胞的增殖情况。2体内实验研究SA/HA水凝胶支架联合hUC-MSCs对TBI大鼠的神经修复作用采用落体撞击法(Feeney’sweight-drop)构建大鼠创伤性脑损伤模型,随机分为 NaCl 组、scaffold 组、hUC-MSCs 组和 scaffold+hUC-MSCs 组。CV 染色观察大鼠脑缺损情况;mNSS评分评估大鼠运动功能恢复;Morris水迷宫法检测大鼠的学习记忆能力;取出大鼠脑组织,做冰冻切片;免疫组化检测脑内hUC-MSCs的存活和迁移;免疫荧光检测神经元标记物β-Ⅲ Tubulin和细胞增殖Ki67的阳性表达;提取损伤侧脑组织蛋白和RNA,Western Blot、qRT-PCR检测组织神经分化相关蛋白和基因(NSE、NEUN、MAP2)的表达,神经营养因子BDNF、NGF、NT3的表达变化、细胞凋亡相关蛋白Bc12的表达。结果1、通过内部凝胶法制备的藻酸盐水凝胶外观呈半透明状,外形可根据所用模具的不同任意塑性;通过SEM表征结果显示,水凝胶内部呈三维多孔网络结构。凝胶时间、含水率、降解率随着SA浓度、f值的减小而呈上升趋势,弹性模量随着SA浓度、f值的减小而下降。通过添加适当比例透明质酸,检测hUC-MSCs在水凝胶中的活性发现,与SA组相比,S4H1、S2H1组中细胞存活率提高(p<0.05)、细胞增殖能力上升(p<0.05),且与HA浓度呈正相关。2、通过落体撞击法成功构建大鼠脑创伤模型;mNSS评分评估发现,治疗组运动功能恢复显著(p<0.05); hUC-MSCs组和scaffold+hUC-MSCs组均能改善大鼠学习记忆能力,且联合组效果更加显著(p<0.05); hUC-MSCs联合支架可减少干细胞于病灶部位的流失,显著增加损伤部位移植的细胞数目(p<0.05);治疗组中β-Ⅲ Tubulin和Ki67表达增加,联合组更加明显(p<0.05);损伤侧脑组织中,NSE、NEUN、MAP2、BDNF、Bcl2 蛋白表达上升(p<0.05), NEUN、MAP2、BDNF、NGF、NT3基因表达水平提高(p<0.05),且联合组效果更加明显。结论1、内部凝胶法可制备任意塑形的可注射性藻酸盐水凝胶,通过调整海藻酸钠浓度、f值的配比,可调控水凝胶的理化性质。2、藻酸盐水凝胶支架可为hUC-MSCs生长提供三维立体支撑,添加透明质酸后,藻酸盐/透明质酸复合水凝胶可增加细胞活性,提高细胞增殖能力,为hUC-MSCs提供良好的生存微环境。3、与单独hUC-MSCs治疗组相比,SA/HA水凝胶联合hUC-MSCs移植可明显改善TBI大鼠的运动功能和学习记忆能力,减少病灶部位干细胞的流失,提高损伤部位神经细胞的再生和神经营养因子的表达,从而改善hUC-MSCs移殖对TBI大鼠的神经修复作用。