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香叶木苷（Diosmin）是一种黄酮苷类化合物,本课题组前期研究已发现香叶木苷在抗辐射、抗癌等方面有显著作用,为进一步研究天然活性成分抗癌作用的通路及靶点,本课题从香叶木苷诱导HepG2细胞凋亡及抑制细胞增殖两方面入手进行深入探讨。主要研究结果如下:首先,研究了香叶木苷对HepG2细胞形态学、增殖能力、运动能力、群体依赖性和细胞凋亡等方面的影响,采用了MTT比色法、细胞划痕实验、细胞克隆形成实验、细胞周期检测的方法,得到如下结果:香叶木苷能够导致HepG2细胞体积变大、肿胀变圆,细胞边界模糊、折光性差;香叶木苷能够抑制HepG2细胞增殖,且呈浓度依赖,300μg/mL的香叶木苷对肝癌HepG2细胞的增殖抑制率达56.32%;香叶木苷能够显著抑制HepG2细胞迁移,300μg/mL香叶木苷对HepG2细胞的48 h迁移抑制率达50.39%;香叶木苷能够抑制HepG2单细胞克隆的形成,300μg/mL香叶木苷对HepG2细胞的15 d细胞克隆抑制率为73.49%;经香叶木苷处理后,G0/G1期细胞显著增加,G2/M期细胞显著减少（P<0.05）,且成一定浓度依赖。上述实验结果说明香叶木苷能够诱导HepG2细胞凋亡并通过引起HepG2细胞G0/G1期阻滞抑制HepG2细胞增殖,预测1个可能抑制细胞周期的信号通路Ras/Raf/MEK/ERK及1个关键靶点Akt。随后,对香叶木苷抑制HepG2细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制进行了研究,通过生物信息学发现在1003例肝细胞癌患者中出现的关键突变位点为:PIK3CA（H1047R/L）、PIK3CA（E545K/A）、AKT1（E17K）、KRAS（G12C/D）,并采用Kaplan-Meier和Log-rank检验法绘制了相关基因突变后肝癌患者生存率与生存时间的曲线图。然后通过Real-time PCR对上述通路进行基因差异表达验证,得到如下结果:在线粒体凋亡途径中,随着香叶木苷浓度的上升,HepG2细胞中Bax mRNA的相对表达量显著上调、Bcl-2 mRNA的相对表达量显著下调,二者比值Bax/Bcl-2上升,均呈浓度依赖。随着香叶木苷浓度的上升,HepG2细胞中Caspase-3 mRNA的相对表达量下调,呈浓度依赖。在Ras/Raf/MEK/ERK通路和PI3K/Akt通路中,当香叶木苷浓度在0-200μg/mL区间时,MEK、ERK、Akt的mRNA相对表达量显著下调,Ras、Raf的mRNA相对表达量无显著变化。香叶木苷浓度在200μg/mL-300μg/mL区间时,Ras、Raf、MEK、ERK、Akt的mRNA相对表达量均无显著变化。上述实验结果说明香叶木苷能够通过线粒体途径诱导肝癌HepG2细胞凋亡,其他通路还需要进一步检测相应蛋白的磷酸化情况。最后,通过Western Blot对线粒体凋亡通路及Ras/Raf/MEK/ERK通路蛋白的相对表达量进行测定,得到如下结果:在线粒体凋亡途径中,随着香叶木苷浓度的上升,HepG2细胞中Bax蛋白的相对表达量显著上调、Bcl-2蛋白的相对表达量显著下调、Bax/Bcl-2的比值显著下调,且均成浓度依赖。随着香叶木苷浓度的上升,HepG2细胞中cleaved-Caspase-3蛋白的相对表达量显著上调,呈浓度依赖。在Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中,香叶木苷浓度在0-200μg/mL区间时,Ras的蛋白表达量显著下调,Raf、MEK、ERK的蛋白相对表达量无显著变化,p-MEK、p-ERK蛋白相对表达量显著下调。当香叶木苷浓度在200μg/mL-300μg/mL时,Ras、Raf、MEK、ERK蛋白的相对表达量无显著变化,p-MEK、p-ERK蛋白的相对表达量继续下调。在Akt相关通路中,随着香叶木苷浓度的上升,HepG2细胞中Akt蛋白的相对表达量无明显变化,而p-Akt蛋白的相对表达量显著上调,呈浓度依赖。上述实验结果说明香叶木苷能够通过线粒体途径诱导肝癌HepG2细胞凋亡。此外,香叶木苷还能够通过Ras/Raf/MEK/ERK途径抑制HepG2细胞增殖,推测香叶木苷可能起到类似MEK抑制剂的作用,通过抑制MEK的磷酸化减少下游信号传递,从而抑制HepG2细胞增殖。