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研究背景:冠状动脉疾病（Coronary artery disease,CAD）是造成全球范围内死亡的最主要原因,因为它阻塞了流向心肌的基本血液流动,导致心肌缺血或心肌梗死（myocardial infarction,MI）。虽然可以通过药物溶栓、介入治疗或外科搭桥等再灌注手段来实现血运重建,但仍有部分患者因冠脉微循环功能障碍而导致心肌灌注不足或无灌注。因此,如何促进MI后血管新生以重新建立缺血性心肌的血液供应尤为重要。成年哺乳动物心脏有微弱的再生能力,但这种微弱的再生能力通常不足以在心脏损伤后产生具有临床意义的心肌修复。不同的是,新生小鼠心脏在受到损伤时具有强大的自我修复能力。心肌再生的关键因素之一是受损组织的血运重建。在正常心脏中,几乎每个心肌细胞旁都有一根毛细血管,内皮细胞与心肌细胞的比值为3:1。表明在新生的早期就建立了冠脉微血管网络。因此,解构新生小鼠损伤修复中调控血管新生的信号分子及相关通路对改善成人缺血性心脏病患者的预后具有关键影响。近年越来越多的研究表明非编码RNA（Non-codingRNA,ncRNA）是心血管疾病发生发展的重要参与者。目前已有文献报道多种微小RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码RNA（Long non-codingRNA,LncRNA）在小鼠新生阶段血管新生中发挥了重要作用,而ncRNA家族的另一成员环状RNA（CircularRNA,CircRNA）是否参与了调控新生阶段的血管新生过程未见报道。通过高通量测序技术分析心脏不同发育阶段或生理病理状态下CircRNA表达情况,发现新生鼠和成年鼠心脏中存在大量差异表达的CircRNA,且不同生理病理状态下CircRNA的表达丰度不同,表明CircRNA与心脏发育、生理和病理过程有着非常密切的关系。本研究通过新生鼠与成年鼠心脏的CircRNA表达谱筛选分析,筛选出环状RNA CircERBB2IP并探讨其作用机制。第一部分环状RNA的筛选及其对乳鼠心脏再生的影响目的:1、筛选、验证并鉴定新生及成年小鼠心脏中差异表达的CircRNA并分析其基本特征。2、体内实验观察敲低CircERBB2IP对乳鼠心肌再生的影响。方法:1、筛选并鉴定环状RNA:通过新生鼠及成年鼠心脏中CircRNA表达谱筛选分析,筛选出环状RNA CircERBB2IP,q RT-PCR检测CircERBB2IP在心脏组织出生后不同时间点（P1、P7、成年鼠）的表达情况。通过设计跨越CircRNA特异性接头序列的q PCR引物,验证其扩增曲线及溶解曲线。Sanger测序确定其环化位点及环化位点序列。RNA酶R（RNase R）检测CircRNA的稳定性,胞质胞核分离实验确定CircRNA的亚细胞定位。2、结扎左冠状动脉前降支建立乳鼠心肌梗死模型,将表达靶向CircERBB2IP的shRNA的ADV载体或空载体注入到左心室心肌中,观察敲低CircERBB2IP对乳鼠心肌梗死后心功能、纤维化程度、心肌细胞增殖及血管生成能力的影响。结果:1、通过新生鼠及成年鼠心脏中CircRNA表达谱筛选出CircERBB2IP,q RT-PCR结果证实在心脏发育过程中,小鼠心脏组织的CircERBB2IP表达显著降低。2、PCR扩增结果提示CircRNA引物的溶解曲线为单峰,Tm值在正常范围之内,电泳条带单一,分子量大小正确,Sanger测序结果为单峰,环化位点正确。RNase R消化降解后,线性ERBB2IP的mRNA水平显著降低,而CircERBB2IP能够抵抗RNase R。胞质胞核分离实验表明CircERBB2IP主要定位于细胞质。3、在乳鼠心肌梗死模型中,与注射对照腺病毒组（ADV-sh NC）相比,注射ADV-sh CircERBB2IP组小鼠表现为:心功能下降,心脏纤维化程度加重,瘢痕面积上升。敲低CircERBB2IP后对心肌细胞的增殖没有影响,但显著减少梗死心肌周围CD31+毛细血管密度和α-SMA+小动脉密度。结论:1、在小鼠心脏发育过程中,CircERBB2IP的表达显著降低;2、敲低CircERBB2IP不利于乳鼠心肌梗死后心脏再生及减弱血管新生。第二部分CircERBB2IP调控心肌微血管内皮细胞（CMECs）的生物学行为改善心肌梗死后心脏修复目的:1、体内实验观察CircERBB2IP对成年小鼠心肌梗死后心脏修复的影响。2、体外观察CircERBB2IP对CMECs增殖、迁移及成管的影响。方法:1、构建具有心脏特异性过表达CircERBB2IP的重组9型腺相关病毒（AAV9-CircERBB2IP）,建立小鼠心肌梗死模型,尾静脉注射过表达小鼠心脏中的CircERBBIP,观察过表达CircERBB2IP后对小鼠心肌梗死后心功能、纤维化程度及血管生成能力的影响。2、CMECs的培养:采用酶消化法联合差速贴壁法培养CMECs。免疫荧光（IF）鉴定CMECs标志物CD31和v WF。3、研究CircERBB2IP对CMECs的生物学行为的影响:通过腺病毒系统过表达或者敲低CMECs中的CircERBB2IP,运用EDU染色检测细胞增殖情况、流式细胞术检测细胞周期、transwell细胞迁移实验检测细胞迁移、小管形成实验观察CMECs的小管形成。结果:1、在小鼠心肌梗死模型中,与注射对照腺相关病毒组（AAV9-Vector）相比,AAV9-CircERBB2IP组小鼠表现为:心功能改善,心脏纤维化程度减轻,瘢痕面积下降,梗死边界区CD31+毛细血管密度和α-SMA+小动脉密度增加。2、酶消化法联合差速贴壁法培养的CMECs,细胞于24h后贴壁,第3天开始生长,6-7天长成致密细胞层,呈铺路石样。IF鉴定其标志物CD31和v WF呈阳性表达。3、体外实验证实上调CMECs中CircERBB2IP的水平促进CMECs增殖、迁移小管形成;而敲低CircERBB2IP则会抑制其增殖、迁移和成管能力。结论:1、成年小鼠心肌梗死后过表达CircERBB2IP促进心脏修复和血管新生;2、CircERBB2IP促进CMECs增殖、迁移及成管。第三部分CircERBB2IP促进CMECs增殖、迁移和成管的机制研究目的:探索CircERBB2IP促进CMECs增殖、迁移和成管的作用机制。方法:1、联合使用JASPAR和UCSC等生物信息学软件预测调控CircERBB2IP的上游转录因子,通过双荧光素酶基因报告实验和CHIP实验验证转录因子GATA4和CircERBB2IP启动子之间的相互作用,并通过q RT-PCR验证转录因子GATA4是否促进CircERBB2IP的转录。2、联合使用Circ MIR 1.0和Starbase等生物信息学软件预测CircERBB2IP可能结合的miRNA,通过双荧光素酶基因报告实验验证CircERBB2IP与miR-145a-5p的结合,胞质胞核分离实验观察CircERBB2IP和miR-145a-5p的亚细胞定位是否一致。3、构建miR-145a-5p的模拟物或抑制剂并作用于CMECs,观察miR-145a-5p对CMECs生物学行为的影响。4、将CircERBB2IP过表达载体与miRNA模拟物共同转染CMECs,用实验研究两者的相互作用是否有功能。5、使用Target Scan和miRanda等生物信息学软件预测miR-145a-5p可能的下游靶基因,并通过双荧光素酶基因报告实验和Western Blot实验验证靶基因的表达情况。结果:1、通过生物信息学软件分析,我们发现转录因子GATA4能靶向调控CircERBB2IP的转录。过表达GATA4可以显著上调CircERBB2IP启动子报告基因的活性,CHIP实验证实GATA4和CircERBB2IP启动子的结合。q RT-PCR结果表明过表达GATA4后可以促进CircERBB2IP的转录。2、miR-145a-5p是CircERBB2IP的靶miRNA分子,miR-145a-5p显著影响CircERBB2IP的荧光素酶活性,miR-145a-5p和CircERBB2IP的亚细胞定位一致,两者均定位于细胞质。3、miR-145a-5p抑制CMECs的增殖、迁移和成管。4、Smad5为miR-145a-5p的调控基因,双荧光素酶报告基因实验证实miR-145a-5p模拟物可以降低Smad5 3’-UTR的荧光素酶活性,过表达或者抑制miR-145a-5p可以使Smad5的蛋白表达水平减低或者增高。5、miR-145a-5p模拟物则可以部分逆转由于CircERBB2IP过表达后对CMECs的增殖、迁移及成管作用。6、过表达CircERBB2IP可以上调Smad5的蛋白表达水平,但这种效应可以被miR-145a-5p模拟物部分逆转。结论:CircERBB2IP通过miR-145a-5p调节Smad5的表达促进CMECs的增殖、迁移和小管形成。