论文部分内容阅读
目的：血管生成方法的探索给治疗缺血性心脏病带来了突破性进展,其目的是通过增加有功能冠状动脉分支或侧枝循环,达到恢复缺血心肌血供,改善患者症状和预后的目的。而血管通透性增加是血管生成序列事件的一个环节。细胞因子和炎症介质大多数是通过改变内皮细胞(ECs)肌动蛋白骨架,使ECs收缩或回缩,细胞间隙增大,导致细胞单层通透性增高；并可破坏血管ECs间粘附连接蛋白VE-cadherin,引起ECs间隙形成,通透性增加。E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近发现的一个细胞转录调控因子,其在分化成熟的组织、细胞中广泛表达,而在去分化的组织中低表达。已有研究表明CREG可促进体外培养的人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化成熟,抑制其增殖、凋亡,并可促进动脉ECs的增殖与迁移,提示CREG对血管的稳态起着调控作用,然而CREG对ECs通透性有何影响尚未见报道。本研究以体外培养的人动脉ECs为研究对象,应用逆转录病毒载体介导CREG在动脉ECs中过表达及表达下调,观察CREG表达对动脉ECs单层通透性的影响,并探讨CREG调节血管ECs通透性的机制。方法：1.采用Transwell chamber弥散模型,分别检测CREG过表达(Overexpression, EO)、表达下调(Suppression, ES)及正常表达(Normal,EN)的人动脉ECs单层通透性的改变。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ECs的VEGF分泌并添加VEGF中和抗体处理,观察对ECs单层通透性的影响。2.利用异硫氰酸盐标记的鬼笔碱对EO、EN及ES的肌动蛋白骨架F-actin进行染色,在荧光倒置显微镜下观察ECs肌动蛋白骨架F-actin分布变化及加入VEGF中和抗体后对ECs肌动蛋白骨架F-actin重排的影响。3.应用免疫荧光染色的方法,在荧光倒置显微镜下观察培养融合至单层的EO、EN及ES三组ECs粘附连接蛋白VE-cadherin及紧密连接蛋白claudin-5表达的变化以及加入VEGF中和抗体处理后对ECs粘附连接蛋白VE-cadherin及紧密连接蛋白claudin-5表达变化的影响。结果：1.CREG过表达的EO组细胞单层通透性明显增加(0.0490±0.0016),与EN对照组(0.0376±0.0061)比较差异显著(p<0.05)。同时,CREG表达下调的ES组单层通透性下降(0.0324±0.0114),与EN对照组0.0376±0.0061)比较差异显著(p<0.05)。ELISA结果显示,与EN组(577.20±10.43)pg/ml相比,CREG过表达的EO组细胞中VEGF分泌量最高(1392.00±5.83)pg/ml,而CREG表达下调的ES组细胞中VEGF分泌量最低(391.40±4.04)pg/ml,三者(EO组、EN组、ES组)均有显著差异(p<0.05)。加入VEGF中和抗体后,EO组细胞单层通透性下降(0.0388±0.0013),与处理前(0.049±0.0017)比较差异显著(p<0.05)。2.荧光倒置显微镜下,可见正常对照EN组ECs连接紧密,F-actin主要分布于细胞膜,呈“花环”样,少量呈细丝状无序分布于胞浆,核周偶有应力纤维形成。EO组ECs呈明显向心性回缩,细胞间隙增大,细胞内F-actin的构像和分布发生变化,边聚现象消失,细胞中心的F-actin明显增多,出现大量的应力纤维,并呈非极性分布和呈典型的竹排样结构。ES组的F-actin主要分布在细胞周边,中心也有少量分布。加入VEGF中和抗体后,EO组肌动蛋白F-actin向细胞膜处转移,以细胞中心为主的分布转变为以细胞周边分布为主,边聚现象有所恢复,相邻细胞间F-actin相互连接,细胞内应力纤维形成有所减少。ES组与EN组则变化不明显。3.荧光倒置显微镜下,正常对照EN组ECs粘附连接蛋白VE-cadherin在血管ECs周边呈正常链状染色,连接紧密。EO组ECs粘附连接蛋白VE-cadherin在血管ECs周边的正常链状染色减少或脱失,细胞间缝隙增宽；紧密连接蛋白claudin-5表达量较EN及ES组明显减少。加入VEGF中和抗体后,EO组ECs粘附连接蛋白VE-cadherin在血管ECs周边的正常链状染色较前增多,连接紧密；紧密连接蛋白claudin一5表达较前增多ES组与EN组则变化不明显。结论：CREG过表达可能通过VEGF介导的信号途径引起体外培养的人动脉ECs骨架蛋白F-actin重构及粘附连接蛋白VE-cadherin、紧密连接蛋白claudin-5表达减少,使血管ECs单层通透性增加。