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目的:⑴研究Akt蛋白在子宫内膜癌细胞株ishikawa(高分化腺癌)和KLE(低分化腺癌)中的定位和表达。⑵研究放射对上述两种细胞系中Akt蛋白表达水平的影响和放射抗拒性的关系。⑶研究P13K/Akt抑制剂(LY294002)对上述两种细胞系放射敏感性的影响。
方法:①培养高分化子宫内膜癌细胞株ishikawa(ISK)和低分化子宫内膜癌细胞株KIE,当细胞近80%融合状态,用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液,以1×106个/孔接种至内置盖玻片的24孔板中培养,24小时后取出爬片,用免疫细胞化学的方法测定Akt蛋白在两种细胞株中的定位和表达。②于细胞爬片24小时后对两种细胞株进行照射,剂量分别为2,4,8,16 Gy(源皮距=100 cm,剂量率:240 eGy/min,瓦里安1800加速器6MV X-ray照射)。于照射后的第1,2,4,16,20,24小时分别取出爬片4%多聚甲醛固定,用免疫细胞化学的方法测定Akt蛋白表达水平的变化。③于细胞照射前4小时分别在两种细胞中加入P13K/Akt抑制剂LY294002(10μmol/L),照射方法同前,于照射后第24小时分别取出爬片4%多聚甲醛固定,测定Akt蛋白的表达水平的变化和LY294002对两种细胞放射增敏的作用。④两种细胞株分别接受单纯照射,LY294002和二者结合处理,用6MV X-ray照射,剂量为4 Gy,于照射后第1,24,48,72小时分别收集细胞,用流式细胞术测定细胞凋亡。细胞免疫化学的图片由Image Pro Plus6.0图像分析软件进行分析,数据用SPSS13.0进行统计学分析,全部检验均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果:⑴ISK和KLE两种细胞中均表达Akt蛋白,定位于细胞浆和细胞核,主要在胞浆中表达,KLE细胞中表达水平高于ISK细胞(P<0.05)。⑵照射后Akt蛋白表达水平提高,随时间变化有统计学意义(P<0.05),于24小时达到高峰。随剂量变化无统计学意义(P>0.05)。⑶LY294002(P13K抑制剂)加照射能显著降低两种细胞中Akt蛋白的表达。差异有统计学意义(P<0.05)。⑷LY294002(P13K抑制剂)单独作用不能降低细胞的存活率,但是结合照射时能显著增加细胞的凋亡分数,与单纯照射相比差异有显著地统计学意义(P<0.05)。
结论:①Ishikawa和KLE两种细胞中均存在P13K/Akt信号通路。②Y294002(P13K抑制剂)增加了ishikawa和KLE细胞对放射的敏感性为筛选放射增敏剂进行临床实验提供了依据。