论文部分内容阅读
研究背景:Schlafen（Slfn）家族基因是Schwarz DA等于1998年发现的参与调控胸腺发育的基因,目前对其所知甚少,所有国内外公开发表的文献只有6篇,仅有的研究表明,该家族基因缺陷可引起一种胚胎致死性表型-DDK综合症。Schlafen家族基因作为一类新发现的基因,其在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。Schlafen1（Slfn1）基因可通过拮抗对Cyclin D1的诱导,从而导致细胞周期终止于G1期。对于Schlafen2（Slfn2）的基因功能目前还不清楚,而且尚未建成能够稳定表达Slfn2基因的细胞系,使其进一步研究收到了限制。因此,探索Slfn2的基因功能对于细胞在基因水平上的研究是一项崭新的课题,这势必为人类基因组的研究进展提供新的视角,从而展开更加多元化的系统研究。目的:（1）将Slfn2基因转入NIH/Swiss小鼠胚胎来源的纤维母细胞样细胞NIH/3T3中,通过绿色荧光蛋白标记观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;（2）建立Slfn2基因稳定表达的细胞系以进一步研究其生物学功能;（3）克隆Slfn2基因启动子区序列,为今后构建双报告基因表达载体、检测荧光素酶的相对活性从而确定和研究小鼠Slfn2启动子的大致区域和相对活性奠定基础。方法:（1）克隆Slfn2基因全编码区序列;（2）构建pEGFP-Slfn2及PCI-neo.Slfn2真核表达载体;（3）瞬时转染pEGFP-Slfn2载体及其空载体对照至NIH/3T3细胞,激光共聚焦显微技术观察细胞中Slfn2基因的表达及分布;（4）用脂质体LipofectamineTM2000分别转染pEGFP-Slfn2与pCI-Sifn2.neo及相应空载体对照至NIH/3T3细胞,G418筛选获得抵制的细胞株;（5）用Northern blot核酸分子杂交技术进一步鉴定Slfn2在各细胞株中的表达情况:（6）利用细胞生长曲线和Transwell侵袭实验检测Slfn2对细胞增殖及迁移能力的影响。（7）克隆Slfn2基因启动子区序列,以便后期将该序列重组至荧光素酶报告载体pGL3-Basic上,连接形成真核表达载体,与pRL-CMV共转染至NIH/3T3细胞,通过双荧光素酶活性的测定来确定和研究小鼠Slfn2启动子的大致区域和相对活性。结果:1.RT-PCR扩增出Slfn2全编码区序列片段,测序分析结果表明与Genebank中登录的Slfn2序列一致。2.所构建的pEGFP-Slfn2及PCI-Slfn2.neo真核表达载体经酶切鉴定并测序,结果表明Slfn2基因与表达载体连接方向正确且无突变,可以进行转染。3.瞬时转染对照及pEGFP-Slfn2质粒,激光共聚焦显微镜下NIH/3T3细胞中核、浆均可见到绿色荧光,说明Slfn2在细胞核、浆均有表达。4.稳定转染pEGFP-Slfn2载体及pCI-Slfn2.neo及其相应的空载体对照于NIH/3T3细胞中,G418筛选得到抵制的细胞克隆;用Northern blot核酸分子杂交技术鉴定并筛选出表达Slfn2的阳性细胞株;扩增培养建立细胞系。实验中获得的阳性细胞株中Slfn2基因均可正确、稳定地表达。5.绘制转染后细胞生长曲线:稳定表达Slfn2基因的细胞增殖速度明显减慢。6.利用Transwell肿瘤细胞侵袭实验分析和检测转染后NIH/3T3细胞的迁移能力:Sifn2基因稳定表达的肿瘤细胞迁移侵袭能力显著降低。7.PCR扩增出Slfn2启动子区序列片段,测序分析结果表明与Genebank中登录的Slfn2序列一致。结论:（1）Slfn2的真核表达载体构建成功,首次获得了Slfn2基因稳定表达的细胞株。（2）Slfn2基因的稳定表达可明显影响肿瘤细胞的生物学特性,对肿瘤的生长增殖和迁移能力起负性调控作用,有效减缓肿瘤增殖速度,限制肿瘤蔓延扩散,即Slfn2基因的表达在肿瘤的发生发展及其转移过程中发挥着重要的作用,可能是一个潜在的肿瘤抑制基因。（3）成功克隆出Slfn2基因启动子区序列,可用于Slfn2启动子大致区域和相对活性的进一步研究。