外泌体,一类直径在50-150 nm具有双层膜结构的细胞外囊泡,存在于生物的各种体液中。外泌体可以通过负载蛋白质、多肽、mRNA、长链非编码RNA、miRNA、环状RNA以及tsRNA调节不同细胞的生物活性。目前,许多研究表明外泌体在肿瘤的形成、迁移和代谢方面发挥着重要作用,同时还与许多疾病的发生密切相关。在精子发生的过程中,精原干细胞除了形成一个走向分化命运的精原细胞外,还会形成一个与自身相同仍旧拥有干性的细胞。在睾丸曲细精管内的“niche”微环境中,支持细胞分泌的各类因子对于精原干细胞的自我维持与更新发挥着重要的作用。附睾和精浆中的细胞外囊泡参与了精子发生的过程中,然而,在曲细精管内支持细胞来源的胞外囊泡对精原干细胞的调节作用所知甚少。本研究对支持细胞分泌的胞外囊泡进行了鉴定,并且探究了其对精原干细胞的影响,主要结果为:(1)收集不同发育阶段小鼠的睾丸,通过免疫组织化学的方法,在曲细精管内对外泌体标志性蛋白质CD63进行了定位。发现在小鼠不同发育阶段,CD63主要定位在支持细胞的细胞质,并且呈颗粒状分布。同时,CD63在小鼠出生后前7 d有很高的表达量,这表明含有CD63的阳性囊泡在精子发生的过程中发挥着重要作用。(2)通过梯度离心和超速离心的方法,首次分离纯化出原代支持细胞释放的细胞外囊泡。在电镜下可以观察到囊泡具有双层膜结构,并且通过纳米颗粒跟踪仪测量出囊泡的大小主要在76 nm左右。利用蛋白质免疫印迹发现分离出的囊泡含有外泌体的特异性蛋白质CD63。因此,从形态特征、粒径大小以及标志性蛋白质这三个方面鉴定出这类囊泡主要是外泌体。(3)用DiI对分离出的外泌体进行标记,发现DiI-外泌体可以附着在C18-4细胞以及原代精原干细胞的表面,呈现颗粒状不均匀分布。(4)在无血清的培养条件下添加100 ng/μL外泌体培养24 h,同时未添加外泌体的细胞作为对照组。发现加入外泌体后,C18-4细胞和原代精原干细胞的状态良好,细胞饱满,表面光滑,而对照组的细胞表面出现大量颗粒,细胞萎缩,细胞状态变差。因此,本研究首次分离纯化出支持细胞来源的外泌体,通过表型分析发现这类外泌体可以附着在精原干细胞表面,并且可以维持精原干细胞的存活。通过本项研究,能够进一步揭示支持细胞调控精原干细胞的方式,对于了解精原干细胞的功能和调控机制开辟了新的视野并奠定了前期的工作基础。