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目的头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)对多种化疗药呈现出耐受性,免疫抑制是主要原因之一,研究发现通过解除免疫抑制可以改善化疗效果甚至达到完全缓解,因此多种免疫疗法应运而生,除免疫检查点阻滞疗法等以外,另一种比较感兴趣的研究是通过促进肿瘤细胞释放危险相关分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs),如细胞膜表面的钙网蛋白(Calreticulin,CALR)和细胞外基质中的ATP及高迁移蛋白l(High Mobility Group Box 1 protein,HMGB1)等,从而增强免疫细胞的成熟、迁移、吞噬及分泌等功能,使其杀伤和吞噬肿瘤细胞,这一过程被称作免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD),且总是伴有内质网应激信号分子真核翻译起始因子 2a(eukaryotic translation initiation factor 2a,eIF2a)的磷酸化,因此P-eIF2a被视作ICD的生物标记。研究发现一些化疗药、放疗及光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)可以诱发ICD,但大部分化疗药在诱导细胞死亡的过程中不伴随DAMPs的释放,甚至会抑制免疫细胞的功能。研究表明溴结构域蛋白4(bromodomain containing protein 4,BRD4)在多数恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关,BRD4抑制剂可以通过抑制细胞周期、下调c-Myc的表达等抑制肿瘤细胞的生长,因而被视作抗肿瘤治疗的重要靶点之一,近年来发现抑制BRD4的表达能对肿瘤免疫微环境起积极性调节作用从而促进抗肿瘤免疫反应,由于抗肿瘤免疫反应的发生基于肿瘤抗原的有效暴露之上,因此本课题主要探讨了 JQ1能否改善肿瘤细胞的免疫原性进而诱发抗肿瘤免疫反应,并选择了头颈鳞状细胞癌中较常见且侵袭性最强的舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)为研究对象,旨在为头颈鳞癌的联合化疗和免疫疗法提供新的思想。方法(1)选择人舌鳞癌细胞系Cal27和小鼠头颈鳞癌细胞系SCC7为研究对象,设置等差浓度梯度,用CCK-8法观察不同浓度下的JQ1对Cal27、SCC7细胞的生长抑制作用,确定适宜浓度进行后续实验(JQ1对Ca127和SCC7的适宜工作浓度分别是4 uM和2 μM),并检测该浓度下Ca127、SCC7细胞内BRD4的mRNA水平及其蛋白表达水平。(2)用JQ1分别刺激Cal27、SCC7细胞一段时间后,1)通过流式细胞术、免疫荧光术检测细胞膜表面钙网蛋白(calreticulin,CALR)及其共转移信号分子ERp57的表达情况,并利用western blot对膜蛋白上CALR/ERp57的表达进行半定量分析;2)根据萤光素酶解发光的原理测定细胞外基质中ATP的含量;3)利用ELISA法检测细胞外基质中HMGB1的变化。(3)用western blot对Cal27和SCC7细胞内PERK/eIF2a的磷酸化进行半定量分析,研究CALR膜向迁移过程中上游通路的变化;利用Annexin V/7-AAD染色分析相同浓度的JQ1诱发肿瘤细胞凋亡的大致时间,并与细胞膜上CALR表达明显升高的时间进行比较。(4)从健康人外周血中提取PBMC细胞,用IL-4、GM-CFS诱导其分化为未成熟的DC细胞,在体外通过舌鳞癌细胞Ca127和上述所获人未成熟DC细胞(immature DCs,im-DCs)的共培养体系更加直接地验证JQ1可以诱发TSCC细胞发生ICD,即以im-DCs为空白对照,以LPS刺激im-DCs为阳性对照,设计JQ1直接刺激imDC、im-DCs和未经刺激的Cal27共培养、im-DCs和经JQ1刺激后的Ca127共培养3种处理方式,用流式细胞术检测DC细胞表面成熟标记CD-86(APC标记)和HLA-DR(FITC标记)的表达情况,用ELISA法测定培养基中细胞因子TNF-a、IL-6的含量并进行比较。(5)将SCC7细胞植入Nu/Nu裸鼠和C3H小鼠皮下建立舌鳞状细胞癌模型,经尾静脉注射JQ1(50mg/kg)后观察肿瘤生长情况,记录并比较2组小鼠模型中肿瘤体积的变化,30天后处死小鼠获取肿瘤标本,称重。结果JQ1可以诱导Cal27和SCC7释放DAMPs,包括CALR、ATP和HMGB1,其中钙网蛋白CALR的暴露较为迅速,4小时后即可检测到膜钙网蛋白的上调(P<0.01),明显早于磷脂酰丝氨酸的暴露,而JQ1作用4h时肿瘤细胞内发生了显著的PERK/eIF2a磷酸化(P<0.01)。Im-DC细胞经与JQ1刺激过的Ca127共培养后细胞表面成熟分子标记CD86和HLA-DR表达上调(P<0.001),共培养体系中DC细胞分泌的IL-6、TNF-a含量亦增加。动物实验发现在免疫正常小鼠和裸鼠模型中JQ1均能抑制肿瘤的生长但在正常小鼠中效果更明显,差异有统计学意义(P<0.01)。结论BRD4小分子抑制剂JQ1能诱导舌鳞状细胞癌发生免疫原性细胞死亡,与已知的化疗药所诱发的ICD类似,这一过程中伴有危险相关分子模式CALR、ATP和HMGB1的释放,并有以PERK/eIF2a磷酸化为标志的致死性内质网应激的参与,进而活化DC细胞,诱发抗肿瘤免疫反应,提示JQ1具有通过诱发ICD改善肿瘤免疫微环境从而提高化疗响应率的潜在应用价值。