【摘 要】
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抗生素在临床上无指征、混乱、过度使用及反复更换现象的出现造成了临床上耐药菌的大量出现。治疗中一旦出现抗生素耐药,则为患者的治疗造成严重的困难,尤其是多重耐药菌对病患的顺利康复带来巨大困扰,危害公共安全。合理使用抗生素是解决此困境的最核心因素之一,这需要临床检验的支撑。临床上常用分离培养加生化鉴定、药敏试验和质谱分析等方法对细菌进行中种属鉴定和药敏分析,但均具有一定的局限性。近年来,分子诊断技术被广
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抗生素在临床上无指征、混乱、过度使用及反复更换现象的出现造成了临床上耐药菌的大量出现。治疗中一旦出现抗生素耐药,则为患者的治疗造成严重的困难,尤其是多重耐药菌对病患的顺利康复带来巨大困扰,危害公共安全。合理使用抗生素是解决此困境的最核心因素之一,这需要临床检验的支撑。临床上常用分离培养加生化鉴定、药敏试验和质谱分析等方法对细菌进行中种属鉴定和药敏分析,但均具有一定的局限性。近年来,分子诊断技术被广泛的应用在细菌鉴定及抗生素耐药基因的检测上,以核酸扩增为主的分子诊断自PCR被发明以来广泛的应用到临床检验中。但是由于耐药机制多种多样,且耐药表型与耐药基因存在不吻合的现象,所以基于耐药基因对耐药表型的判别并不是最佳的。在本研究中,通过本地Blast及在线Blast对大肠杆菌全基因组进行筛选,得到该菌的特异基因hypothetical protein gene（ID:13702648）。经验证,此特异基因在240株大肠杆菌中广泛存在,在150株非大肠杆菌菌株中不可检出,故可作为细菌种属鉴定特异基因。结合大肠杆菌在抗生素存在时的增菌培养,建立了PCR和q PCR快速分子药敏检测体系。PCR和q PCR快速分子药敏检测体系均可在30-60分钟的增菌时间内对102-4CFU/m L的原始浓度的菌液进行药物敏感性的准确检测,总检测时间均不超过2.5小时。PCR可在60分钟的增菌时间内对102CFU/m L的原始浓度的菌液进行药物敏感性的准确检测,在30分钟的增菌时间内对103-4CFU/m L的原始浓度的菌液进行药物敏感性的准确检测。q PCR可在最短30分钟的增菌时间内对最低102CFU/m L的原始浓度的菌液进行药物敏感性的实时、准确检测。将q PCR快速分子药敏检测体系用于临床样本左氧氟沙星、氨曲南、氨苄西林、阿米卡星抗生素耐药性评估,检测结果与医院药敏结果一致。综上所述,本研究将传统药敏鉴定与分子诊断有机结合,成功的构建了基于细菌特异基因的PCR、q PCR快速分子药敏鉴定方法。具有直观、简单、快速、灵敏度和特异性高等特点,可在2.5小时内鉴定临床样本中常见多药物耐药病原体的感染情况并明确其耐药表型,提供快速精准检测细菌种属及其抗生素耐药的方法,为相关诊断试剂开发提供技术基础。
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