副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)和猪支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是引起猪发生呼吸道综合征(PRDC)的重要致病因子。机体在各种应激因素的影响下或感染导致免疫力下降的病毒性疾病时,均易导致Hps和Bb的感染率大大增加。这两种病原菌混合感染情况十分普遍,且都易引起猪呼吸道隐性感染及急、慢性炎症,临床症状相似不易区分,给临床诊断和防治带来困难。本研究依据Hps OMP P2基因和Bb DNT基因成功建立了一种快速、简便、精准和灵敏的可同时检测具有毒力的副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的诊断方法。通过试验证实,建立的双重PCR法特异性强,敏感性高,重复性好,并成功应用于临床实践。1.双重PCR方法的建立依据Hps OMP P2和Bb DNT基因序列各设计1对引物,并对引物进行二聚体、同源性、互补性分析,试验预计分别能扩增出748 bp和344 bp的DNA片段。利用设计的引物分别对Hps OMP P2基因和Bb DNT基因进行PCR扩增,并在单一PCR基础上进一步优化双重PCR的反应条件,包括引物浓度、退火温度、延伸时间、dNTPs浓度、rTaq DNA polymerase浓度和镁离子浓度的优化。最终确立双重PCR最佳试剂组分(25μL反应体系)为：10×PCR Buffer(Mg2+ free) 2.5μL, rTaq DNA Polymerase 0.3μL,25mM MgCl2 2μL,dNTP Mixture 2μL,Hps-F和Hps-R各0.8μL,Bb-F和Bb-R各0.5μL,模板2 μL,加ddH20补至251.μLPCR反应程序为：95℃预变性5 mim；95℃变性40 s,55℃退火50 s,72℃延伸50 s,35个循环；72℃再延伸10 min,4℃保存。用建立的双重PCR方法对各血清型gps和Bb进行检测,结果毒力菌株可检测出,而非毒力菌株不能检测出,表明本方法适用于对具有毒力的Hps和Bb进行快速诊断。特异试验结果显示：本方法只能检测出Hps和Bb,而对肺炎支原体、传染性胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎沙门氏菌、猪链球菌和大肠杆菌不能检测出；敏感性试验结果表明该方法能检测出gps和Bb的最低核酸浓度分别达到1.79×10-3μg/μL及8.3×10-3 μg/μL;重复性试验结果一致。说明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。2.双重PCR方法与其他检测方法效果比较用建立的双重PCR对来自四川部分地区的36份PRDC病料进行检测并与单一PCR和细菌分离作比较,结果显示,Hps和Bb的阳性检出率分别是33.33%和5.56%。双重PCR与细菌分离阳性符合率分别为83.33%和50%,双重PCR与单一PCR阳性符合率达到100%。结果说明双重PCR具有与单一PCR相同的敏感性,并且其敏感性高于细菌分离。3.双重PCR方法的临床应用用本试验建立的双重PCR方法对来自四川部分地区的120份PRDC病料进行检测。检测结果显示,肺组织是Hps和Bb检出率最高的部位；感染Hips的病料有38份,感染Bb的病料有17份,统计出Hps和Bb的阳性检出率分别是31.67%、14.17%。5份检出为Hps和Bb的混合感染,混合感染率为4.17%；本方法同样适用于对菌落和组织样品的检测。本研究通过分别对不同地区、不同季节、不同日龄Hps和Bb的感染情况进行统计和分析,从不同地区感染情况来看,Hips在四川地区已普遍存在,Bb呈散在性分布,并且两种病原菌在四川地区均形成一定的流行趋势,从不同季节感染情况来看,冬季和春季较夏季和秋季更易感染Hps和Bb,从不同日龄感染情况来看,Hps和Bb在猪30至60日龄段的阳性率最高。这一研究结果为Hips和Bb在临床生产上的预防和控制提供基础。