1.报告基因法筛选克拉维酸高产菌 2.报告基因法比较两种放线菌启动子的活性

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第一部分:报告基因法筛选克拉维酸高产菌克拉维酸(clavulanic acid,CA),又名棒酸,是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物,其分子为一个稠合双环β-内酰胺结构,由β-内酰胺环(C3结构)和唑烷环(C5结构)构成。它特有的3R,5R立体结构使其具有抑制β-内酰胺酶的活性,可与β-内酰胺酶的丝氨酸活性位点不可逆结合,使β-内酰胺酶失活,从而保护β-内酰胺类抗生素的活性。其本身的抑菌作用非常微弱,临床上主要与β-内酰胺类药物联合应用。本研究用报告基因的方法,对NTG诱变的含报告基因的工程菌进行筛选得到克拉维酸高产的突变菌株。报告基因载体将克拉维酸生物合成调节基因ccaR的启动子,置于报告基因的前面构建出重组报告载体。本研究使用了自主构建的双报告基因,即串联表达的卡那霉素抗性基因(neo)和邻苯二酚2,3-双加氧酶基因(xylE),降低了单报告基因筛选的一些缺陷。将重组载体转入野生菌株中,再对菌株进行NTG诱变。由于载体上的启动子与基因组中的相关基因的启动子是一样的,所以报告基因的表达变化反映了基因组中的相关基因的表达变化。我们对报告基因表达提高的菌株再进行复筛,以确定真正产量提高的菌株。得到了一株高产菌,其克拉维酸的产量大约是野生菌的4倍。本研究还建立了一种快速便捷的克拉维酸产量显色筛选方法,依次通过菌株的平板滤纸片筛选、发酵液的96孔板法筛选和HPLC筛选的一系列步骤,快速的筛选评价突变菌株。第二部分:报告基因法比较两种放线菌启动子的活性链霉菌(Streptomycetes)是一类主要来源于土壤的高G+C%含量革兰氏阳性菌,具有复杂的次级代谢。链霉菌的代谢过程是一个非常复杂、相互偶联的多层次调控过程,而启动子和其它顺式调控序列构成了这个调控系统中的基础部分。链霉菌基因的启动子结构具有多样性,在转录模式上普遍存在复杂性。本研究比较启动子Psf与红霉素抗性基因启动子(PermE*)在链霉菌中的表达强度差异。利用卡那霉素抗性梯度以及邻苯二酚2,3-双加氧酶显色系统,比较了两个启动子的表达差异。两个启动子在棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585、天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor M145,委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae ISP5230及变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK54中均高表达。在棒状链霉菌和天蓝色链霉菌中Psf的表达活性要强于PermE*。Psf和PermE*都是适用于链霉菌的高活性启动子。这些数据为两个启动子的使用提供了参考依据,也为链霉菌基因表达元件提供了新的选择。
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