神经干细胞（neural stem cells,NSCs）因其组织修复及跨越血脑屏障的能力被认为在神经系统疾病的治疗中有重要价值,并成为再生医学和干细胞领域研究的热点。在机体内不同区域干细胞巢的NSCs有各自区域特异性的表型,临床前动物研究和临床试验提出,区域特异性NSCs对相同区域受损组织的修复与再生能力更强,如脊髓区域特异性NSCs治疗脊髓损伤的效果优于大脑区域特异性NSCs,因此体外培养获得脊髓区域特异性NSCs的方法对于治疗脊髓损伤有重要意义。目前已有研究报道了获得脊髓特异性NSCs的方法,但步骤较为复杂且成本较高,本研究提出了一种不同于前人报道的,简单高效获得脊髓特异性NSCs的方法,即利用添加小分子化合物CHIR-99021和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）的化学成分明确的培养体系,由人多能干细胞诱导获得稳定的NSCs,将其命名为CLNSCs,随后以CLNSCs为研究对象,对其表型特征、基因表达模式及其维持自我更新的重要信号通路进行了研究。一、CLNSCs诱导方法的建立与鉴定使用N2B27添加CHIR-99021和LIF的培养条件（CL）诱导人多能干细胞,为了验证方法的普适性,使用了1个胚胎干细胞系和2个诱导多能干细胞系。诱导2-3天即可形成表达NESTIN和N-cadherin的神经玫瑰花环（neural rosettes）结构,7-10天获得可稳定传代的神经球。得到的CLNSCs可通过神经球培养方法传代50代以上。CLNSCs的多能性标记基因OCT4和NANOG表达下调,而早期神经标记NESTIN、SOX2和PAX6升高,同时CLNSCs可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。异种嵌合研究结果显示CLNSCs注入小鼠第六天胚胎（E6.5）,将嵌合胚胎于体外培养2天后,注入的CLNSCs仍然表达NESTIN和TUBB3,并整合到小鼠表达外胚层标记的区域。二、CLNSCs的脊髓特异性分子表达模式对CLNSCs的基因表达模式进行RNA-seq数据分析,结果显示CLNSCs的基因表达功能富集与神经命运决定高度相关。基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）结果显示CLNSCs富集到脊髓相关的GO（gene ontology）本体,包括脊髓模式、脊髓背侧/腹侧模式和脊髓发育。脊髓区域特异性标记HOXA1-4、HOXA7、HOXB1-4和HOXC4明显升高,而低表达大脑组织特异性NSCs标记基因FOXG1和OTX2。三、Wnt信号通路在CLNSCs中的作用CLNSCs的KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路富集到显著变化的Wnt信号通路,其中经典Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin降解复合体成员AXIN2和APC2高表达,β-catenin（CTNNB1）表达较hPSCs减弱,Wnt/β-catenin靶基因c-MYC转录水平显著下调,同时免疫荧光染色呈阴性。加入Wnt/β-catenin抑制剂IWR-1和XAV939培养CLNSCs,获得了可稳定传代神经干细胞系CLINSCs（添加IWR-1）和CLXNSCs（添加XAV939）细胞系,CLINSCs和CLXNSCs与CLNSCs表型相似,低表达OCT4不表达NANOG,高表达神经标记SOX2、NESTIN、PAX6,并与CLNSCs同样具有向三系神经细胞分化的能力,表明CLNSCs自我更新不依赖经典的Wnt/β-catenin信号通路的激活。而RNA-seq富集的非经典Wnt信号通路中,WNT7A、WNT7B、WNT5A和WNT5B在CLNSCs中高表达,提示CLNSCs的自我更新可能与非经典的Wnt信号通路有关。综上所述,本研究提出的无血清无转基因的CL培养体系,成分明确,方法简单,可高效将人多能干细胞诱导为神经干细胞,获得的CLNSCs表现出脊髓区域特异性,不但可作为研究神经发育的细胞模型,也能作为干细胞移植治疗神经系统疾病的细胞来源,将来在临床应用中有广阔的前景。