在动物生殖过程中，卵巢颗粒细胞扮演着极其重要的作用，不仅可以调控卵泡的发育，还能为卵母细胞提供营养和信号传导。颗粒细胞增殖过程中会发生多种表观遗传修饰，其中，组蛋白乙酰化修饰与颗粒细胞类固醇激素分泌、细胞凋亡和周期密切相关。作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，曲古抑菌素A(TSA)可以促进细胞的乙酰化，提高基因序列的正常性，在猪牛等动物颗粒细胞上多有研究，在特种动物上鲜有报道。本试验以梅花鹿卵巢颗粒细胞为研究对象，进行颗粒细胞的体外培养、增殖活性检测、凋亡周期检测以及组蛋白乙酰化研究等一系列试验，探讨TSA对梅花鹿颗粒细胞活性、类固醇激素分泌、细胞凋亡以及组蛋白乙酰化的影响，以期探明梅花鹿颗粒细胞增殖过程中组蛋白乙酰化的修饰机制。本试验一共包括以下几个内容:　　1、颗粒细胞的分离、体外培养和鉴定:利用活体采卵技术收集卵泡液，低速离心，从卵泡液中分离梅花鹿颗粒细胞，用基础培养液DMEM/F12添加10％胎牛血清和1％青链霉素培养颗粒细胞，通过FSHR抗体荧光手段结合HE染色鉴定颗粒细胞。结果表明，梅花鹿卵巢颗粒细胞生长良好，HE染色细胞形态完整，FSHR阳性率＞90‰由此得出梅花鹿颗粒细胞纯度高于90％，可以进行后续实验。　　2、TSA对梅花鹿颗粒细胞增殖活性及雌二醇和孕酮分泌的影响:用含有不同浓度TSA(0nM、10nM、50nM、100nM、500nM)的DMEM/F12培养液处理颗粒细胞48h，用CCK法检测细胞的增殖活性，用ELISA法检测细胞培养液中雌二醇和孕酮水平。结果发现，TSA对梅花鹿颗粒细胞的生长具有抑制性，并且这种抑制性呈剂量依赖效应。ELISA检测发现，当TSA浓度为10nM和50nM时雌二醇水平明显上升(p＜0.05)，并且在50nM时最高(p＜0.05)。而当TSA浓度为100nM时，雌二醇水平开始下降，但仍高于对照组(p＜0.05)且低于10nM时的水平(p＜0.05)，500nM时的分泌水平与对照组差异不显著(p＞0.05)。孕酮检测发现，当TSA浓度为10nM、50nM、100nM时，三者之间孕酮水平差异不显著(p＞0.05)，但均高于对照组(p＜0.05)，而当TSA为500nM时，孕酮的分泌量低于对照组(p＜0.05)。说明TSA浓度低于100nM时可以促进雌二醇和孕酮的分泌，浓度为500nM时不利于二者的分泌。　　3、TSA对梅花鹿颗粒细胞凋亡的作用和周期分布的影响:采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法和PI单染法结合流式细胞仪，分别检测不同浓度TSA处理后的颗粒细胞的凋亡和周期分布;用qRT-PCR技术检测凋亡相关蛋白(BCL-XL、BAX、GLUT3、GLUT8)和周期相关蛋白(Cyclin D2、CDK4)的基因表达量。试验结果发现，TSA具有促进颗粒细胞凋亡的作用，对细胞G2期没有明显影响，但当浓度高于10nM时，它会呈现出对G1期的促进作用，及对S期的抑制作用。QRT-PCR结果表明，随TSA浓度升高，GLUT3、GLUT8、BCL-XL、Cyclin D2和CDK4的mRNA表达均呈现出递减趋势(p＜0.05)，而BAX的mRNA表达呈递增趋势(p＜0.05)。　　4、TSA对梅花鹿颗粒细胞组蛋白乙酰化的影响:采用qRT-PCR技术检测不同浓度TSA处理后颗粒细胞表观遗传修饰酶DNMT3a、DNMT1、HAT1、HDAC1的基因表达水平，采用免疫荧光技术和western blotting技术分别检测颗粒细胞H3K9和H4K8的乙酰化水平。结果表明，随着TSA浓度的增加，DNMT3a、DNMT1和HAT1的表达先递增后递减，且在TSA为50nM时表达最强(p＜0.05)，而HDAC1的表达呈递减趋势。免疫荧光技术和western blotting技术检测都发现，随TSA浓度的增加，H3K9和H4K8乙酰化水平均增强，并且H4K8乙酰化程度高于H3K9乙酰化。　　综上所述，本试验证明TSA对梅花鹿颗粒细胞的体外增殖有抑制作用，适当浓度TSA(50nM)可以促进梅花鹿颗粒细胞类固醇激素的分泌，高浓度(500nM)不利于其分泌;TSA可以诱导颗粒细胞的凋亡，使细胞周期阻抑在G0/G1期，并能提高梅花鹿颗粒细胞组蛋白的乙酰化。以此为契机，未来可以进一步研究TSA对梅花鹿卵母细胞体外成熟的作用。