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背景全球每年新发的胃癌患者100多万，我国的胃癌发病人数占其中的42%；全球胃癌患者死亡人数约80万，我国占其中的35%。因此，我国是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一。在我国排名前5的癌症中，胃癌的发病率仅次于肺癌位居第二位，死亡率为第三位[1]。胃癌的发生是一个缓慢的复杂过程，一般认为其发展顺序为慢性浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生(不典型增生)→胃癌。在这些过程中涉及了许多基因的表达调控，如原癌基因和抑癌基因。目前，胃癌的发生机制仍不十分清楚，深入探讨这一机制，有利于寻找治疗胃癌的药物靶点。microRNAs(miRNAs)是一类长度约为22nt的非编码RNAs，在基因转录后调节中发挥重要作用，参与细胞的生长发育、分化、增殖、凋亡等[2]。大量的报道证实miRNAs在胃癌的发生中发挥十分关键的作用，如原癌基因miR-21, miR-155, miR-222, miR-223等。MiR-25作为原癌基因在多种肿瘤中表达上调，其通过抑制一些抑癌基因在肿瘤的发生过程中起重要作用[3-7]。一个miRNA可以作用多个靶基因，发挥不同的生物学功能，因此，鉴定miRNA作用的靶基因具有重要意义。目前，miR-25在胃癌发生中的作用机制尚未完全阐明，其调节的靶基因也极少地被鉴定，明确miR-25在胃癌中调节的关键靶基因有利于阐明胃癌的发生机制。目的明确miR-25在人胃癌及癌旁正常组织中的差异表达，预测和鉴定miR-25的靶基因，为阐明miR-25在胃癌发生中的作用机制提供线索。方法1.分析miR-25在人胃癌及癌旁正常组织中的表达。采用TRIzol法提取10例人胃癌及癌旁正常组织样本中的总RNAs，qRT-PCR相对定量方法检测miR-25的表达量，以U6作为内参。2.生物信息学方法预测miR-25的靶基因。采用miRNATarget Database数据库预测miR-25的靶基因3.实验初筛miR-25的靶基因，分析其在胃癌组织中的表达及与miR-25表达的相关性。3.1采用脂质体2000分别转染miR-25mimics和miR-25control于AGS细胞，qRT-PCR相对定量法检测TOB1和IQGAP2的表达情况(β-actin作为内参)，选择表达显著降低的基因作为候选靶基因。3.2qRT-PCR相对定量法检测TOB1在10例胃癌及癌旁正常组织中的表达(β-actin作为内参)，分析其与miR-25的相关性。4.miR-25靶基因TOB1的鉴定4.1荧光素酶活性实验。在实验组中，将miR-25mimics，pMIR-TOB1和pRL-TK(内标载体)共转染HEK293细胞；在对照组中，用miR-25control替换miR-25mimics进行转染。转染24h后，采用dual liciferase reporter assay system裂解细胞，通过GloMax20/20Luminometer检测荧光强度。4.2荧光报告实验。将miR-25control和pMIR-GFP-empty、miR-25mimics和pMIR-GFP-empty、 miR-25control和pMIR-GFP-TOB1、 miR-25mimics和pMIR-GFP-TOB1分别共转染HEK293细胞。转染24h后，用倒置荧光显微镜观察荧光，然后用FACSC aliburTMsystem检测荧光强度。4.3分别转染miR-25mimics和miR-25control于AGS细胞，提取细胞总蛋白，Western blot方法检测TOB1蛋白在AGS细胞中的表达。结果1.在10例配对胃癌组织样本中，miR-25在8例胃癌组织中的表达高于配对的癌旁正常组织，中位数统计分析显示，miR-25在胃癌组织中显著高表达(P<0.01)。2.miR-25的靶基因预测结果显示TOB1和IQGAP2(肿瘤相关基因)是miR-25的候选靶基因。3.miR-25候选靶基因初筛实验结果显示，miR-25mimics组TOB1mRNA的表达水平显著低于miR-25control组(P<0.05)，而IQGAP2mRNA的表达水平在两组之间无显著差异(P=0.4195)。TOB1mRNA在胃癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P<0.01)，且与miR-25的表达呈负相关(P=0.0480)。推测TOB1可能是miR-25的靶基因。4.成功鉴定了TOB1是miR-25的靶基因。4.1实验组中荧光素酶活性相比对照组显著降低(P<0.01)，证实miR-25mimics对pMIR-TOB1的荧光素酶表达有抑制作用，提示TOB1是miR-25的靶基因。4.2miR-25mimics和pMIR-GFP-TOB1共转染组荧光强度显著降低，而其它三组荧光强度无显著差异，证实miR-25mimics对pMIR-GFP-TOB1的GFP表达有抑制作用，提示TOB1是miR-25的靶基因。4.3miR-25mimics组TOB1蛋白水平的表达相比miR-25control组显著降低，证实miR-25mimics能抑制AGS细胞中TOB1蛋白的表达。结论1.miR-25在人胃癌组织中高表达且与TOB1在胃癌组织中的低表达呈负相关，可能与胃癌的发生相关。2.首次证实了TOB1是miR-25的靶基因，提示miR-25能结合TOB1的3’UTR下调TOB1mRNA和蛋白的表达，从而发挥促癌作用，为探讨miR-25在胃癌发生中的作用机制提供了新的线索。