中文摘要 第一部分 TLR4 基因多态性的研究目的:基因学研究发现人类 TLR4 基因第四外显子第 896 位的 A/G 错义突变可导致 TLR4 蛋白 299 位的天冬氨酸被甘氨酸取代(也称“Asp299Gly”基因多态性),并导致 TLR4 受体的细胞外域发生改变。国外有关研究发现这一单核苷酸多态性(SNP)可影响 LPS 的信号转导,被认为可能在人类对内毒素的反应及脓毒症的发生发展过程中起着重要作用,具有重要的研究价值。由于突变携带者在人群中比例很低,要在人群中开展这方面的研究,首先必须建立一种适合较大规模地检测、方便、快速的内毒素膜受体 TLR4 基因多态性“Asp299Gly”的方法,以便进一步研究该位点对人内毒素反应及脓毒症病人病理生理的影响。方法:根据等位基因特异性 PCR 的原理,设计两个等位基因特异性引物,并在两个等位基因特异性引物的 3′端第 3 位碱基引入不配对以增加特异性,经琼脂糖凝胶电泳后分析确定样本的基因型。另外采用 PCR 定点突变方法得到含和不含“Asp299Gly”突变位点的 DNA 片段插入质粒作为标准模板,用以验证两个等位基因特异性引物的鉴别效果,并参照采用国外文献中成熟的“采用PCR-RFLP 原理的“Asp299Gly”分析技术加以验证。并首次在中国汉族人群进行该位点的初步筛查。结果:成功地建立了一种独创的、经济、快速、准确的检测内毒素膜受体TLR4基因多态性“Asp299Gly”的方法,该方法用于“Asp299Gly”的检测特异性好,鉴别效果确实。 但在 92 份 DNA 样品中未找到含有该突变点的样品。结论:该方法简便、快速、准确、经济,适合于一般实验室。中国汉族人群携带这一突变的基因频率与西方人种相比是否存在人种差异,需要进一步大样本的研究。 第二部分 外周血体外培养加内毒素刺激的实验研究目的: 建立用于人类内毒素反应研究的全血细胞培养加内毒素刺激的实验模型,观察不同浓度内毒素刺激对全血细胞产生细胞因子 TNFα、IL-6、IL-10 的影响,观察不同浓度的内毒素刺激对单核细胞表面 TLR4、CD14 蛋白的影响,了解内毒素反应的分子机制。方法:体外用不同浓度的内毒素刺激 RPMI1640 -3-<WP=7>第二军医大学 中文摘要 硕士学位论文培养液稀释的全血细胞,采用荧光标记的 TLR4 及 CD14 单克隆抗体和流式细胞仪分析技术检测单核细胞表面 TLR4、CD14 的变化,采用双抗体夹心 ELISA法检测细胞因子。结果:1. 培养 6 小时后,LPS 浓度为 0ng/ml 对照组无细胞因子测出,LPS 浓度在 0.01ng/ml 以上各组均可见 TNFα、IL-6、IL-10 的产生。2. 在 LPS 刺激浓度 0.01-10ng/ml 范围内三种细胞因子的产生浓度与 LPS 均有较明显的剂量-效应关系,10ng/ml 以上则表现为平台期,各组间差异不明显(p>0.05)。3. LPS 刺激浓度为 0.1ng/ml、10ng/ml 时可使单核细胞表面的 CD14蛋白水平明显下调(P<0.01),LPS 刺激浓度为 0.01ng/ml 组单核细胞表面的CD14 蛋白水平也表现为下调,但不明显(P>0.05)。 LPS 刺激浓度为 10ng/ml的浓度对单核细胞表面的 CD14 蛋白水平的下调效应明显大于 0.1ng/ml 的浓度(P<0.01)。4. LPS 刺激浓度为 0.1ng/ml、10 ng/ml 两组均可见 TLR4 蛋白水平的明显升高(P<0.05), 0.01ng/ml 组也可见升高,但不明显(P>0.05),同时统计结果显示 0.01ng/ml、0.1ng/ml、 10ng/ml 三组间无明显差异(P>0.05)。结论:1. LPS 浓度达到 0.01ng/ml 时即可激活炎症细胞因子反应,0.01—10ng/ml的 LPS 刺激浓度与细胞因子的 TNFα、IL-6、IL-10 产生有较好的剂量-效应关系,2.一定浓度的内毒素刺激可明显下调单核细胞表面的 CD14 蛋白表达水平,下调的程度和 LPS 刺激浓度有关。而一定浓度的内毒素明显上调单核细胞表面的 TLR4 蛋白表达水平,由于 TLR4、CD14 是内毒素的特异性受体,这种变化对机体或细胞对内毒素反应的影响需要进一步研究。 第三部分 围术期内毒素受体 TLR4、CD14 及细胞因子的变化目的:围术期炎症细胞因子的变化被认为与临床预后息息相关,而内毒素膜受体被认为是炎症反应的重要初始环节,是炎症信号转导最上游的关键分子,因此围术期内毒素膜受体的变化及调控机制的阐明对深入研究和探索围术期炎症反应的分子机制有着非常重要的意义,可能为我们提供新思路,为防治过激性炎症反应及免疫失衡,合理调控免疫反应,为术后脓毒症、多脏器功能衰竭等严重威胁生命的并发症的防治工作带来新的希望。但到目前为止,围术期有关内毒素膜受体的变化尚未见研究报道,因此我们通过检测围术期病人血浆内毒素浓度及内毒素受体 TLR4 及 CD14 的变化及炎症细胞因子的变化情况进行了初步的研究工 -4-<WP=8>第二军医大学 中文摘要 硕士学位论文作。方法:选取接受手术治疗的肝脏肿瘤病人 8 例(男性 4 例,女性 4 例,均为右肝肿瘤,术中均未输血,围术期未用免疫治疗药物,硬膜外复合全身麻醉。),围术期不同时间点(麻醉前,术中 45 分钟,术毕,术后 2 小时,术后一天、两天、三天)分别取静脉血检测血浆内毒素浓度、单核细胞表面 TLR4、CD1