研究背景:在各种自身免疫性疾病中,系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)被视为经典研究模型,几乎可以模拟各种自身免疫性疾病的临床表现。研究表明,SLE的发生是各种因素共同作用的结果,其中遗传易感因素是影响SLE发生发展的重要环节之一。目前普遍认为,这种影响是通过多基因变异共同作用的,单个等位基因的作用虽小,但是其累积效应极大地增加了SLE的患病风险。Pellino1(Peli1,人类编码基因PELI1,小鼠编码基因Peli1)蛋白是RING(really interesting new gene)指样泛素连接酶成员之一。许多研究表明,Pellino1与多种炎症和自身免疫性疾病的发病相关。Chang等报道,Peli1缺陷小鼠会表现肾脏损害以及产生自身抗体等狼疮症状,这是由于Peli1缺陷对c-Rel调控异常导致的。c-Rel是NF-κB转录因子家族成员之一,是维持T细胞活化的关键分子。还有研究发现,Pellino1对TLR3刺激促炎细胞因子的表达,以及B细胞的活化起重要作用。在其他的TLR信号途径和NF-κB活化调控中,Pellino1还通过与已知的SLE易感基因白介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)相互作用来影响SLE相关信号通路。但是目前为止,尚未见关于人类PELI1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与SLE相关性的研究。IRAK1是IRAK激酶家族被发现的第一个成员,与多种免疫性疾病和炎症性疾病相关。研究发现,IRAK1缺陷的狼疮易感小鼠SLE相关表型消失,包括Ig M和Ig G自身抗体、淋巴细胞活化和肾脏损害,并可逆转树突状细胞过度活化。此外,还与诱导IFN-α和IFN-γ产生、NF-κB活化有关,这些重要的炎症反应事件均在SLE发生、发展发挥重要的作用。IRAK1是IL-1R/TLR信号途径的关键分子,IRAK1将Pellino1磷酸化后,可以极大地激活它们的E3活性,反之对IRAK1泛素化;同时,活性改变的IRAK1与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)相互作用,继而导致各种转录因子活化,造成许多重要的固有免疫和获得免疫信号被激活。越来越多的研究证实,Th17在SLE发病过程中发挥极其重要的作用,IL-17在*本课题受国家自然科学基金资助(NO.81271753)sle中通过影响细胞和体液免疫两方面来促进狼疮的炎症反应。人类th17功能异常是与il-1r/tlr信号传导异常密切相关的,irak1可以选择性地对th17转录因子调控,从而影响th17细胞亚群的数量和功能,但具体机制仍有待研究。鉴于peli1和irak1这两个基因在调节免疫和炎症发生发展中发挥重要的作用,了解上述两个基因在sle发病中的作用及其关联性显然有重要的意义。为此,本课题分为两个部分,第一部分采用病例对照方式研究peli1基因多态性与sle的相关性,实时荧光定量pcr和westernblot技术观察患者外周血peli1基因mrna和蛋白水平表达水平。第二部分研究irak1基因多态性与sle的相关性,并通过荧光素酶报告基因实验对编码区的阳性关联snp位点的生物学功能意义进行初步的实验研究。通过本研究,希望从遗传学角度探讨peli1和irak1基因多态性与sle易感性的关系,为sle的临床治疗提供新的线索。研究一peli1基因与系统性红斑狼疮的关联研究目的:比较sle患者和正常对照者peli1基因的3个snp位点(rs329497、rs329498和rs10496105)的基因型和等位基因分布频率的差异,分析各个基因型和等位基因与sle易感性的关系,构建该基因3个snp位点的单体型并分析与sle的相关性,同时结合临床资料,分析其与sle肾脏损伤之间的关系。检测sle患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)中的peli1基因的mrna和蛋白水平整体表达情况,为sle发现新的生物标记物提供线索。方法:1.基因多态性关联分析:收集两所三甲医院的sle病例395名,患者均符合1997年美国风湿病学会(americancollegerheumatology,acr)修订的sle分类标准,合并其他严重系统性疾病者排除。正常对照组378名,各项体检指标均正常,不具备sle诊断标准中的任一项,无重大疾病史。提取所有样本dna,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)技术检测peli1基因的3个snp位点(rs329497,rs329498和rs10496105)的基因型,采用χ2检验和logistic回归分析比较各多态位点在sle病例组与对照组间的基因型频率及等位基因型频率差异,进行狼疮性肾炎的分层分析。采用sas?9.2和haploview4.2软件进行计算两两位点间的连锁不平衡并构建单体型,分析比较sle病例组与对照组间的单体型频率差异,进行狼疮性肾炎的分层分析。p<0.05表示差异具有统计学意义。2.pbmc中的peli1基因的mrna和蛋白水平表达检测:实时荧光定量pcr技术检测两组pbmc中peli1基因mrna的表达量;免疫印迹法检测pellino1蛋白表达量。实验数据用spss13.0统计软件进行分析,以p﹤0.05表示有显著性差异。结果:1.peli1基因3个位点多态性与sle易感性的关系1)rs329497:sle患者组基因型aa、ag、gg的频率分别为6.0%、38.9%和55.1%,而对照组为9.6%、43.4%和47.1%。sle患者组等位基因a和g的频率为25.5%和74.5%,对照组为31.3%和68.8%。sle患者组与对照组相比,rs329497位点基因型的频率分布无显著性差异(p>0.05),两组等位基因g的频率分布差异有统计学意义(gvs.a,pcorrect=0.036,or=1.33,95%ci=1.06-1.67)。2)rs329498:sle患者组基因型cc、ac和aa的频率分别为8.4%、39.2%和52.4%,而对照组为10.6%、42.9%和46.6%。sle患者组等位基因c和a的频率为28.0%和72.0%,对照组为32.0%和68.0%。两组间rs329498位点基因型频率、等位基因频率的分布差异均无统计学意义(p>0.05)。3)rs10496105:基因型aa、ag和gg的患者组频率分别为3.3%、19.7%和77.0%,对照组为1.1%、23.0%和75.9%。sle患者组等位基因a和g频率为13.2%和86.8%,对照组则为12.6%和87.4%。两组间rs10496105位点基因型、等位基因的频率分布均无显著性差异(p>0.05)。2.peli1基因3个位点多态性与狼疮肾的关系狼疮肾组rs329497检出aa、ag、gg三种基因型的频率分别为5.6%、42.4%和52.0%,而非狼疮肾组则为5.8%、33.3%和60.8%;狼疮肾组a和g等位基因频率为26.7%和73.2%,非狼疮肾组则为22.5%和77.5%。狼疮肾组rs329498检出cc、ac和aa三种基因型的频率分别为6.5%、43%和50.5%,而非狼疮肾组则为8.1%、34.1%和57.7%;狼疮肾组c和a等位基因频率为28.0%和72.0%,非狼疮肾组则为25.2%和74.8%。狼疮肾组rs10496105检出aa、ag和gg三种基因型的频率分别为2.0%、18.0%和80.0%,而非狼疮肾组则为4.1%、17.1%和78.9%;狼疮肾患者组a和g等位基因频率为11.0%和89.0%,非狼疮肾组则为12.6%和87.4%。但未发现peli1基因3个位点的基因型、等位基因的频率分布差异具有统计学意义(p>0.05)。3.peli1基因3个位点的单倍型与sle易感性的关系分析计算两两位点间的连锁不平衡系数,rs329497、rs329498和rs10496105位点存在一定的连锁相关性,构建长度6kb的单体型域。单体型g-a-g在sle患者组和正常对照组中的频率都是最高的,分别为73.9%和67.8%;其次是a-c-g,在sle患者组占13.2%,正常对照组占19.3%。以g-a-g为参照,a-c-g在sle患者组和正常对照组中的分布差异具有统计学意义(p=0.001,or=0.63,95%ci=0.47-0.83)。or值≥1.00携带rs329497等位基因g的g-a-g和g-c-g与其他单体型合并比较,sle和健康组g-a-g和g-c-g的分布差异具有统计学意义(p=0.008,or=1.36,95%ci=1.08-1.69)。4.peli1基因3个位点的单倍型与狼疮肾的关系分析狼疮肾患者单体型占比例最高的是g-a-g,为72.7%,其次是a-c-g,占16.1%。非狼疮肾组中占比例最高的单体型也是g-a-g,为76.7%,其次是a-c-a,占12.1%。各单体型在狼疮肾组和非狼疮肾组中的分布频率无显著性差异(p>0.05)。5.sle患者及健康对照pbmc中peli1基因mrna及蛋白表达量的比较与健康对照组相比,sle患者pbmc中peli1mrna表达略高于对照组,但是统计分析两组间差异无显著性意义(p﹥0.05)。sle患者peli1基因编码蛋白表达量与健康对照组之间无显著性差异(p﹥0.05)。结论:rs329497的等位基因g可能是sle发病的危险因素之一。单体型a-c-g是sle的保护性单体型;g-a-g和g-c-g这两种单体型是sle的风险单体型,这个危险因素可能受到rs329497等位基因g的影响;peli1基因多态性与sle存在关联性。研究二irak1基因与系统性红斑狼疮的关联研究目的:比较sle患者和正常对照者irak1基因的6个snp位点(rs1059702、rs1059703、rs3027898、rs7061789、rs5945174和rs2239673)的基因型和等位基因分布频率的差异,分析各个基因型和等位基因与sle易感性的关系,构建该基因6个snp位点与sle有关联意义的单体型,同时结合临床资料,分析其与sle肾脏损伤之间的关系。并且利用荧光素酶报告基因初步探讨外显子区rs1059702、rs1059703位点多态性对th17相关转录因子的影响。方法:1.基因多态性关联分析:收集两所三甲医院的sle病例395名,正常对照组378名(基本情况参见研究一),提取所有样本dna,采用maldi-tofms技术检测irak1基因的6个snp位点(rs1059702、rs1059703、rs3027898、rs7061789、rs5945174和rs2239673)的基因型,采用χ2检验和logistic回归分析比较各多态位点在sle病例组与对照组间的基因型频率及等位基因型频率差异,进行狼疮性肾炎的分层分析。采用sas?9.2和haploview4.2软件进行计算两两位点间的连锁不平衡并构建单体型,分析比较sle病例组与对照组间的单体型频率差异,进行狼疮性肾炎的分层分析。p<0.05表示差异具有统计学意义。2.荧光素酶报告基因检测:构建四种不同载体pcdna3-irak1-(587c+1595t)、pcdna3-irak1-(587t+1595t)、pcdna3-irak1-(587c+1595c)和pcdna3-irak1-(587t+1595c),转染hek293t细胞株,检测th17相关转录因子的活性变化。实验数据用spss13.0统计软件进行分析,以p﹤0.05表示有显著性差异。结果:1.irak1基因6个位点多态性与sle易感性的关系1)外显子区:①sle患者组rs1059702检出tt、ct和cc三种基因型的频率分别为69.5%、26.9%和3.6%,对照组为58.2%、34.6%和7.2%。sle患者组等位基因t和c的频率为83.0%和17.0%,对照组为75.5%和24.5%。两组间rs1059702基因型tt与ct+cc的频率分布相比有显著性差异(ttvs.ct+cc,pcorrect=0.020,or=1.64,95%ci=1.22-2.20),等位基因t的频率分布差异有统计学意义(tvs.c,pcorrect=0.002,or=1.58,95%ci=1.23-2.03)。②sle患者组rs1059703检出cc、ct和tt三种基因型的频率分别为71.0%、25.4%和3.6%,对照组为59.5%、33.1%和7.4%。sle患者组等位基因c和t的频率为83.7%和16.3%,对照组为76.1%和23.9%。两组间rs1059703基因型cc与ct+tt的频率分布相比有显著性差异(ccvs.ct+tt,pcorrect=0.014,or=1.66,95%ci=1.23-2.25),等位基因c的频率分布差异有统计学意义(cvs.t,pcorrect=0.001,or=1.62,95%ci=1.26-2.08)。2)3’utr区:sle患者组rs3027898检出cc、ac和aa三种基因型的频率分别为71.3%、25.4%和3.3%,对照组为61.9%、32.0%和6.1%。sle患者组等位基因c和a的频率为84.0%和16.0%,对照组为77.9%和22.1%。两组间rs3027898位点基因型cc、ac和aa的频率分布无显著性差异(p>0.05),等位基因c的频率分布差异有统计学意义(cvs.a,pcorrect=0.013,or=1.49,95%ci=1.15-1.93)。3)内含子区:①sle患者组rs7061789检出gg、ag和aa三种基因型的频率分别为72.7%、24.1%和3.3%,对照组为63.1%、30.8%和6.1%。sle患者组等位基因g和a的频率为84.7%和15.3%,对照组为78.5%和21.5%。两组间rs7061789位点基因型gg、ag和aa的频率分布无显著性差异(p>0.05),等位基因g的频率分布差异有统计学意义(gvs.a,pcorrect=0.012,or=1.51,95%ci=1.17-1.96)。②sle患者rs5945174检出gg、ag和aa三种基因型的频率分别为71.9%、24.8%和3.3%,对照组为61.9%、31.7%和6.3%。sle患者组等位基因g和a的频率为84.3%和15.7%,对照组为77.8%和22.2%。两组间rs5945174位点基因型gg、ag和aa的频率分布无显著性差异(p>0.05),等位基因g的频率分布差异有统计学意义(gvs.a,pcorrect=0.006,or=1.53,95%ci=1.18-1.98)。③sle患者组rs2239673检出cc、ct和tt三种基因型的频率分别为71.9%、24.8%和3.3%,对照组为62.6%、31.3%和6.1%。sle患者组等位基因c和t的频率为84.3%和15.7%,对照组为78.2%和21.8%。两组间rs2239673位点基因型cc、ct和tt的频率分布无显著性差异(p>0.05),等位基因c的频率分布差异有统计学意义(cvs.t,pcorrect=0.014,or=1.62,95%ci=1.15-1.93)。2.irak1基因6个位点多态性与狼疮肾的关系1)外显子区:①狼疮肾组rs1059702检出tt、ct和cc三种基因型的频率分别为67.5%、29.5%和3.0%,非狼疮肾组为69.7%、27.1%和3.3%。②狼疮肾组rs1059703检出cc、ct和tt三种基因型的频率分别为69.8%、27.1%和3.0%,非狼疮肾组为70.5%、26.2%和3.3%。2)3’utr区:狼疮肾组rs3027898检出cc、ac和aa三种基因型的频率分别为69.8%、27.1%和3.0%,非狼疮肾组为70.7%、26.8%和2.4%。3)内含子区:①狼疮肾组rs7061789检出gg、ag和aa三种基因型的频率分别为70.0%、27.0%和3.0%,非狼疮肾组为73.2%、24.4%和2.4%。②狼疮肾组rs5945174检出gg、ag和aa三种基因型的频率分别为70.5%、26.5%和3.0%,非狼疮肾组为71.5%、26.0%和2.4%。③狼疮肾组rs2239673检出cc、ct和tt三种基因型的频率分别为70.0%、27.0%和3.0%,非狼疮肾组为72.4%、25.2%和2.4%。未发现irak1基因6个位点的基因型、等位基因的频率分布差异具有统计学意义(p>0.05)。3.irak1基因6个位点的单倍型与sle易感性的关系分析irak1基因的6个snp位点计算两两位点间的连锁不平衡系数,6个位点之间存在着紧密连锁相关性,构建长度8kb的单体型域。单体型t-g-g-c-c-c在sle患者组和正常对照组中的频率都是最高的,分别为82.7%和75.1%;其次是c-a-a-t-t-a,在sle患者组占14.7%,正常对照组占21.1%。以t-g-g-c-c-c为参照,c-a-a-t-t-a在sle患者组和正常对照组中的分布差异具有统计学意义(p=0.001,or=0.64,95%ci=0.49-0.83)。合并除了单体型t-g-g-c-c-c以外的所有单体型为参照,t-g-g-c-c-c在sle患者组和正常对照组中的分布差异具有统计学意义(p<0.001,or=1.60,95%CI=1.24-2.07)。4.IRAK1基因6个位点的单倍型与狼疮肾的关系分析狼疮肾患者占比例最高的是单体型T-G-G-C-C-C,为82.1%,其次是C-A-A-T-T-A,占15.7%。非狼疮肾组占比例最高的也是单体型T-G-G-C-C-C,为82.6%,其次是C-A-A-T-T-A,占14.0%。各单体型在狼疮肾组和非狼疮肾组中的分布频率无显著性差异(P>0.05)。5.荧光素酶报告基因实验结果显示:在IL-1β的刺激下,两位点多态性对转录因子RORγt、STAT3、IRF4的活性影响无显著性差异(P>0.05)。结论:IRAK1基因外显子区rs1059702位点基因型TT、rs1059703位点基因型CC是SLE的风险基因型;3’UTR区rs3027898位点等位基因C、内含子区rs7061789位点等位基因G、rs5945174位点等位基因G、rs2239673位点等位基因C可能是SLE的危险等位基因。IRAK1基因6个位点构建的单体型中,C-A-A-T-T-A是SLE的保护性因素;包含了所有本研究发现的6个危险等位基因的单体型T-G-G-C-C-C是SLE的风险单体型。IRAK1基因多态性与SLE存在关联性。