背景:结核病在世界范围内,每年大约造成100-200万人死亡,在本世纪仍然是严重威胁人类健康的主要传染病,虽然感染率及死亡率有一定的下降趋势,但总体医疗负担仍然很重。结核病的早期诊断对于结核病的治疗以及控制结核分枝杆菌的广泛传播具有重要意义,目前结核病的实验室诊断主要依赖痰涂片抗酸染色镜检法、结核分枝杆菌培养和核酸扩增检测,但各种方法均有不同的缺点或受到实验室环境、设备的限制,很难得到全面推广,因此迫切需要一种新的结核病实验室诊断方法,实现更高效的筛查策略。随着结核分枝杆菌全基因组测序研究的深入开展,除了传统的16SrRNA、23SrRNA、IS6110、rpoB和mtp40等分子标志,新近发现的分子靶标和分子生物学方法的改进相结合,可稳健地用于结核分枝杆菌的构建及检测。目的:mts90是一种最新发现的人型结核分枝杆菌的分子靶标,但mts90的检测较为困难,临床中难以常规开展。本研究旨在建立一种敏感性及特异性均高、检测程序快速简便、更适用于实际临床的mts90检测方法。同时,规范化收集结核菌感染的临床标本,以探讨新构建的检测方法对结核病的临床应用价值。方法:以重组酶聚合酶扩增(RPA)技术对人型结核分枝杆菌的分子靶标mts90进行扩增检测。对所有引物和探针的二级结构进行检测并进行第一轮检测,筛选出最佳引物序列。对构建的mts90质粒标准品进行连续稀释,分别稀释成8 copies、8×10~1copies、8×10~2copies、8×10~3copies、8×10~4copies、8×10~5copies浓度,分别分析mts90 RPA检测法的灵敏度。以mts90质粒为阳性对照,以三种结核分枝杆菌菌种ATCC27294(人型结核分枝杆菌)、CMCC95049(非洲结核分枝杆菌)、CMCC95006(胃肠型结核分枝杆菌)及常见呼吸道病原体,如肺炎链球菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等为模板,提取所有病原体的基因组DNA,对比分析mts90 RPA法与PCR-荧光探针法以评价方法的特异性。对2018年6月-2019年2月收治的70例结核患者,分别采用抗酸染色法、结核分枝杆菌培养法、PCR-荧光探针法和构建mts90 RPA法同时检测患者样品,以评价人型结核分枝杆菌新靶标mts90 RPA检测的临床应用价值。结果:(1)Western-blot检测发现,引物F3/R7(序列为CCTCTGACCAGGCGACATAG ACAACAGTACCC/CACGCGGCCGTCGGGGCCGGTGTAGCTGGCTTGCC)的扩增效果最明显。探针(序列为CAGAGCATAGACACGATCTTGGAAGGTTTCAG T(THF)AAC(BHQ-dT)CCGTGGCGTGTCTCTTATTG-Spacer)筛选引物的反应产物蛋白表达最明显。可用于进一步实验。(2)当mts90质粒标准品的稀释液浓度介于8×10~0~8×10~5copies之间时,质粒均可得到明显的扩增信号,且随着浓度的升高,扩增荧光信号越明显。为避免反应偶然性,我们对每个浓度稀释液进行了至少3次的重复检测,均得到阳性反应,大约在10min左右时,出现明显的扩增信号,且反应时间与模板浓度呈显著负相关关系。(3)RPA方法检测发现,仅有ATCC27294(人型结核分枝杆菌)菌种出现了阳性扩增信号,而其他菌种,包括CMCC95049(非洲结核分枝杆菌)、CMCC95006(胃肠型结核分枝杆菌)均未观察到扩增信号。琼脂糖凝胶电泳检测发现了与PCR反应相同的趋势。这表明,mts90 RPA具有较高的特异性。(4)我们对mts90 RPA法与其它三种最常用检测方法的检测性能进行比较分析,结果发现,mts90 RPA法检测阳性率显著高于痰涂片抗酸染色镜检法(卡方值为12.919,P<0.01),与结核杆菌培养法和PCR-荧光探针法相比无显著差异(P>0.05)。mts90 RPA、PCR的平均检测时间为11.9min、28.4min,最大检测时间分别为为19.6min、75min。这表明,两种检测方法的特异度及敏感度均接近,可在一定程度上相互替换。但mts90 RPA法的检测时间显著较短,且操作步骤简单,更具有操作优势。结论:结核分枝杆菌新靶标mts90 RPA检测方法较传统痰涂片抗酸染色镜检法和结核杆菌培养法具有更高敏感性,与传统PCR方法相比,其操作更加简便、反应时间更短,由于该方法对实验环境和条件要求不高,因此更适合在基层医疗机构普及,为结核病早期诊断提供了新的筛查工具。