hpalXoo(=hrfA,HR function)基因是本实验室通过PCR方法,从水稻黄单胞白叶枯细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)JxoⅢ菌株中克隆到的。hpalXoo全长420 bp,编码的Hpalxoo(=harpinXoo)具有其它harpin蛋白所共有的生物活性:激发烟草过敏性坏死反应(hypersensitive response,HR),诱导烟草对多种病原物的抗性。但是harpinxoo还显示一些独特性:含有半胱氨酸(Cys),分子量比其它已报道的harpin都小。为了进一步明确HpalXoo的分子机理,我们通过生物化学和生物物理方法以及转基因技术研究了HpalXoo的结构与功能及其关系。　　 与空载体粗蛋白相比,HpalXoo粗蛋白能使烟草产生HR,圆二色(circulardichroism,CD)光谱具有α-螺旋的典型特征。柱层析发现HpalXoo蛋白存在两种洗脱组分A和B。空间排阻色谱(size-exclusion chromatography,SEC)和分析超速离心(analytical ultracentrifugation,AUC)沉降速率(sedimentation velocity,SV)实验分析表明组分A是HpalXoo的二聚体形式,而组分B是单体形式。组分A与B都能激发烟草产生HR,且都具有α-螺旋的特征CD谱,但存在含量和构象上的差异。CD数据拟合表明组分A的α-螺旋含量明显高于组分B,A不存在β-折叠二级结构,而B含有一定量的β-折叠。Hierarchical Neural Network方法预测分析表明HpalXoo的N端和c端各有一个α-螺旋二级结构域,总螺旋含量与CD谱拟合分析的结果的相一致。同时也发现HpalXoo存在丰富的固有无序结构区域。　　 化学合成了HpalXoo的截短多肽片段AB(59aa)、CD(34aa)和EF(47aa)。AB+CD+EF=HpalXoo。在AB、CD和EF所在区域中随机选择10个氨基酸残基进行了化学合成,分别表示为AB10、CD10、EF10,其中EF10中富含甘氨酸(含有1个GGG-GG基序)。除了AB多肽具有与野生型全长harpinXoo相当的HR活性外,其余多肽都未能在烟草上检测到明显的HR活性。AB与CD多肽能引起烟草产生微过敏反应(micro—HR),而EF、AB10、CD10和EF10则不能。CD光谱分析表明AB多肽水溶液CD谱具有典型的α-螺旋特征,α-螺旋的含量达到22.4％,而CD和EF多肽不具有α-螺旋特征的CD谱,拟合分析表明二者都不含有α-螺旋。SEC聚体分析表明AB多肽水溶液主要以三聚体形式存在,存在两相结构过程:三聚体H单体(变温圆二色结果)；CD多肽水溶液主要以单体形式存在,少数是二聚体；EF多肽水溶液主要以二聚体形式存在,少量是单体形式。而AB10、CD10和EF10三个多肽的聚合度比较高,都在6-8聚体以上。AB、CD和EF多肽都具有一定的诱导烟草在处理叶片(LAR)和未处理叶片(SAR)抗TMV的特性,而AB10、CD10和EF10多肽诱导烟草植株抗TMV的能力要弱一些,其中EF10的诱抗能力相对要强一些。　　 生物信息学分析发现HpalXoo有两个区域具有形成卷曲螺旋(coiled-coil,CC)的潜能,一个区域是在HpalXoo的N端,形成CC的可能性高；另一个是在C端,形成CC的可能性非常低。在HpalXoo的两个CC区域,我们设计并合成了几个含有14-21个氨基酸残基的多肽及其突变多肽,并用生物物理化学的方法测定和分析了这些CC区域的结构和功能。我们发现HpalXoo的c端和N端一样具有诱发烟草产生HR的能力。与野生型多肽相比,干扰HpalXooN端CC形成的突变多肽和有助于C端CC形成的突变多肽都丧失了激发烟草产生HR的能力,以及它们的聚体形式都发生了改变；这说明在HpalXoo的N端,CC区域是激发烟草产生HR功能必需的,而在HpalXoo的C端情况则相反,即CC不是HR所必需的。实验结果也表明,位于N端CC区域的14aa多肽片段(LDQLLCQLISALLQ)是激发烟草产生HR的最小和独立的功能单元。同时,我们也对HpalXooN端CC区域的3个heptad(7个氨基酸重复单元)进行了分析,并推测这3个heptad在HpalXooN端赋予激发烟草HR功能方面具有各自不同的职责.特定的多肽的聚体结构是激发烟草产生HR功能所必须的。这些化学合成的多肽都具有一定的诱导烟草产生局部或系统抗病性的能力。为了探明黄单胞菌(Xanthomonas species)Hpal同源物N端α-螺旋区域中的CC是否在激发烟草产生HR中的具有普遍的重要作用,我们又合成了水稻细菌性条斑病菌(X.o.pv.oryzicola)、大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)、甘蓝黑腐病菌(X.campestris pv.campestris)和辣椒斑点病菌(X.campestris pv.vesicatoria)Hpal同源蛋白N端对应区域的21aa多肽(3个heptad),发现CC形成可能性高及具有α-螺旋结构的多肽赋予了其对应Hpal同源物(Harpins)在烟草上的HR功能。同时通过变温圆二色光谱发现HpaGXag-N21和HpalXoo-N21多肽存在两相结构过程。　　 本实验室已成功将hpalXoo基因及其截短片段AB,CD转入烟草,获得转基因烟草植株。收获实验室已有的转基因烟草T1代种子,并进行种子继代组织培养,相继获得T2代和T3代转基因烟草植株。通过对转入基因的PCR及测序验证,证实了目的基因和片段转入了烟草植株,同时也在转录水平验证了目的基因和片段的转录表达。提取的转基因可溶性蛋白注射亲本烟草也能相应地引起HR。转基因烟草叶片无肉眼可见的HR斑,但都存在micro-HR现象；对烟草花叶病毒(TMV)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora,Pcc)都有不同程度的抗病性。在转AB、CD和hpalXoo的转基因烟草植株中都能检测到HR标志基因hsr203J及hsr515的表达。同时转基因烟草都能表达抗病防卫反应相关基因pal、PR—1a、Chia5、ChtA。