胃癌是严重危害人民健康的疾病。在全球范围内，胃癌发病率占所有恶性肿瘤的第四位，死亡率占第二位，每年约有100万的新发患者。其中，60％的新发病例在亚洲。胃癌是目前中国的第三大常见肿瘤，根据2005年的资料，中国胃癌发病率在男性中达37.1/10万，女性中为17.4/10万。每年新发胃癌患者达40万人，死亡人数达30万人。手术是胃癌治疗的主要方法，但疗效仍徘徊不前，总体5年生存率仅30％左右。 影响胃癌预后的因素一直是临床关注的热点问题，但各家报道不一。本论文中，我们首次通过906例大样本资料，对胃癌D2术后患者的预后因素进行分析，探讨胃癌临床病理因素在预后的意义，以更进一步指导临床治疗。 同时，随着分子生物学的不断发展，预测胃癌预后的分子指标也已成为肿瘤研究的主要方向。近年来，表皮生长因子受体EGFR(epidermal growth factor receptor)，血管内皮生长因子受体VEGF(vascular endothelial growth factor)等在胃癌预后方面的意义已给予很大关注。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路是当前肿瘤治疗的新热点，它的调控异常与肿瘤发生密切相关。在肝癌、乳腺癌、胆管癌中已经证明，mTOR的活化形式磷酸化的mTOR(p—mTOR)高表达与预后呈负相关，是肿瘤治疗的新靶点，但p—mTOR与胃癌预后的关系鲜见报道。 本论文中，我们进一步研究了胃癌组织中p—mTOR的表达意义，分析它与胃癌预后的关系，并通过研究mTOR抑制剂依维莫司(RAD001)及联合化疗对胃癌细胞的作用机理，来探讨mTOR作为胃癌潜在治疗靶点的可行性。 第1部分906例胃癌根治术后预后多因素分析 目的：影响胃癌预后的因素很多，文献报道差异较大。本研究根据淋巴结转移数目的不同，在新的角度分析胃癌患者的预后，以加深对胃痛生物学行为的认识。 方法：回顾性分析中山大学肿瘤医院1990年1月至2002年12月间接受D2根治术的胃癌患者906例。根据淋巴结检取个数不同分为两组：第一组，淋巴结个数≤15，729例；第二组，淋巴结个数>15，177例。淋巴结转移率分组：N ratio0，0％；N ratio1，1％—9％；N ratio2，10％—25％；N ratio3，>25％. 结果：两组的5年生存率分别为49.9％和53.1％。单因素分析表明，两组资料中肿瘤浸润深度、淋巴结转移个数、淋巴结转移率均与生存相关；但多因素分析显示仅肿瘤浸润深度和淋巴结转移率是影响患者术后生存的独立因素。进一步分析显示，在淋巴结检取个数不同时，相同的淋巴结转移率预后没有统计学差异。 结论：肿瘤浸润深度和淋巴结转移率是影响患者D2术后的独立影响因素。淋巴结转移率是一个比淋巴结转移个数更好的指标，在淋巴结检取个数不足时，它仍然能够判断患者预后。 第2部分 p—mTOR在181例胃癌中的表达与预后的关系 目的：mTOR在多种肿瘤组织中均有表达，但其与胃癌关系的研究国内尚无报道。本章旨在检测中国人胃癌组织中mTOR的活化形式p—mTOR的表达，并探讨其与胃癌浸润转移及预后的关系。 方法：采用免疫组化方法检测181例胃癌组织中p—mTOR蛋白的表达情况，并结合患者的临床病理资料分析其与胃癌浸润转移相关性，通过COX模型多因素分析与胃癌患者预后的关系。 结果：所检测的181例胃癌标本中p—mTOR蛋白表达阳性93例，阳性表达率为51.4％，p—mTOR阳性表达与胃癌的淋巴结转移及临床分期密切相关；而与年龄，性别，肿瘤大小，病理T分期等临床病理特征无显著性相关(p>0.05)。p—mTOR阳性的病人的总生存率与无病生存率明显比p—mTOR阴性的病人短(DFS，p=0.006and OS，p=0.011，respectively)。多因素分析中，p—mTOR的表达与预后呈相关趋势。 结论：p—mTOR蛋白在胃癌组织中的阳性表达与胃癌的淋巴结转移、临床分期、肿瘤进展密切相关，可能成为预测胃癌转移的新分子标志物和治疗靶点。 第3部分 RAD001联合化疗对胃癌细胞的作用及机理 目的：探索RAD001单药以及与胃癌常用化疗药物ADM、5-FU、TAXOL、DDP联合应用是否对胃癌AGS、BGC823、MKN28细胞有抑制作用并探讨其机制。 方法：将RAD001单药以及其分别与化疗药物ADM、5-FU、TAXOL、DDP药物联合作用于人胃癌AGS、BGC823、MKN28细胞，用MTT法检测RAD001单药及联合用药对胃癌细胞的抗增殖作用；用流式细胞学(PI染色)检测RAD001单药对胃癌细胞凋亡/周期阻滞的影响；应用Western—blot分析P13K/Akt/mTOR直接底物蛋白p70s6k、p—p70s6k以及凋亡/周期相关蛋白P53、Bcl—2、C—myc、CyclinD1表达情况。 结果：RAD001单药作用于人胃癌AGS、BGC823、MKN28细胞48小时后，测得IC50值分别为23.1μmol/L、21.7μmol/L、13.8μmol/L，提示RAD001单药对胃癌细胞均有抗增殖活性。RAD001单药作用于AGS、BGC823、MKN28细胞48小时，流式细胞仪显示胃癌细胞主要被阻滞在G1期，凋亡率随药物浓度而升高。Western—blot分析表明，mTOR底物p70s6k、p—p70s6k明显下降，周期相关蛋白C—myc及CyclinD1表达均下降，凋亡相关蛋白P53表达增加、Bcl—2表达下降，证实了RAD001是通过改变下游p70S6K磷酸化水平而起作用，通过降低C—myc及CyclinD1的表达而使细胞通过G1-S期的检查点下降，将细胞阻滞在G1期，并可能通过抑制凋亡抑制蛋白Bcl—2，促进促凋亡蛋白P53表达而诱导胃癌细胞的凋亡。RAD001单药分别与化疗药物ADM、5-FU、TAXOL、DDP以固定浓度混合共同作用于AGS、BGC823、MKN28细胞，结果采用金正均法显示：RAD+ADM联合呈现协同作用，RAD+5FU、RAD+DDP联合呈现拮抗作用，RAD+Taxol联合呈现单纯相加作用。流式细胞仪显示凋亡率较各单药组升高。Western—blot分析表明，mTOR底物p70s6k、p—p70s6k较各单药组下降，与单独用药相比，凋亡相关蛋白P53表达增加、Bcl—2表达下降，这表明，RAD001作用于AGS、BGC823、MKN28细胞48小时后，与对照组蛋白表达情况相比，p70s6k、p—p70s6k在实验组表达明显受到抑制，提示RAD+ADM的协同作用是通过阻断靶点mTOR，使P13K/AKT/mTOR信号路的下游受到抑制，并可导致细胞凋亡，导致肿瘤细胞生长受到抑制。 结论：RAD001单药及化疗药物ADM、5-FU、TAXOL、DDP药物对人胃癌AGS、BGC823、MKN28细胞均有良好抗增殖作用；RAD+ADM联合呈现协同作用，RAD+5FU、RAD+DDP联合呈现拮抗作用，RAD+Taxol联合呈现单纯相加作用；这些作用是通过改变下游p70S6K磷酸化水平，使细胞停滞在G1期，并可能通过抑制凋亡抑制蛋白Bcl—2，促进促凋亡蛋白P53表达而诱导细胞凋亡而实现。