目的和意义:利用化学还原法制备了聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体并研究其理化性质、表征参数及细胞毒性、转染效率。通过静电吸附作用将纳米金基因载体与含st TRAIL目的基因片段的重组质粒DNA按一定质量比结合构建了st TRAIL-纳米金复合物,并应用该复合物联合热休克处理肝癌细胞,观察其对热休克肝癌细胞的增殖活性、细胞凋亡等的影响,并探讨st TRAIL-纳米金复合物促进热休克肝癌细胞凋亡的相关机制。方法:1.利用化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用紫外分光光度计检测纳米金颗粒的吸收光谱及最大吸收峰处波长,在透射电镜下观察纳米金颗粒的表观形貌特征,用激光粒度仪检测纳米金颗粒的粒径大小及其分布,用表面电位仪检测纳米金颗粒的表面电位(Zeta电位),用1%的琼脂糖凝胶电泳实验检测纳米金基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8试剂盒检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导p Ac GFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率。2.将纳米金基因载体与含stTRAIL目的基因片段的重组质粒DNA按不同质量比混合,1%琼脂糖凝胶电泳实验检测st TRAIL-纳米金复合物结合的稳定性,CCK-8试剂盒检测其对SMMC7721细胞的细胞毒性,确定纳米金与重组质粒DNA结合的最佳质量比。st TRAIL-纳米金复合物联合热休克处理肝癌细胞后,用CCK-8试剂盒检测其对肝癌细胞SMMC7721的增殖活性的影响,并用流式细胞术检测该复合物联合热休克处理肝癌细胞后促进肝癌细胞凋亡的作用。3.Real-time PCR和Western blot分别检测TRAIL信号通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA、蛋白质水平的表达差异,探讨st TRAIL-纳米金复合物促进热休克肝癌细胞凋亡的相关机制。结果:1.聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到表面带正电荷的纳米金颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为12.3±3.3 nm。在PH=7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)m V。1%琼脂糖凝胶电泳实验结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面。体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导p Ac GFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25%。2.琼脂糖凝胶电泳实验表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,重组质粒DNA可完全结合到纳米金颗粒表面。CCK-8试验表明,纳米金与重组质粒DNA按质量比5:1结合时形成的复合物相对稳定,且对细胞毒性较弱,最适合转染st TRAIL基因。用按此比例结合的stTRAIL-纳米金复合物联合热休克处理肝癌细胞,能明显抑制肝癌细胞增殖活性,显著地促进肝癌细胞凋亡。3.Real-time PCR结果表明,经过st TRAIL-纳米金复合物联合热休克处理的肝癌细胞组,TRAIL信号通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA表达明显增高。Western blot结果同样表明,实验组TRAIL信号信号通路下游Caspase-8、Caspase-3等蛋白质表达明显上调。结论:通过化学合成的纳米金基因载体具备制备简便、成本低、转染效率较高的特点。2.st TRAIL-纳米金复合物按质量比5:1结合较稳定,能够转染st TRAIL基因。该复合物能够在热休克条件下能够显著地抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。3.st TRAIL-纳米金复合物促进热休克肝癌细胞凋亡可能是通过纳米金载体递送TRAIL基因,使TRAIL基因过表达,上调TRAIL信号通路,促使下游凋亡相关分子Caspase-8、Caspase-3等表达增加,从而促进肝癌细胞凋亡。