论文部分内容阅读
背景肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,由于缺乏明晰的发病机制,尚难以早期诊断和进行特异性治疗,预后差。多项研究表明肺癌组织hnRNP B1和丙酮酸激酶M2型(PKM2)水平异常增高,且与肺癌细胞增殖有关。PKM2作为参与有氧氧化的丙酮酸激酶M1型(PKM1)的同工酶,与后者同源,结构相似,但参与肺癌细胞有氧糖酵解,保证细胞增殖时能量代谢和物质合成的平衡。PKM2和PKM1是同一条pre-mRNA经外显子的不同选择性剪接而分别形成。HnRNP B1作为细胞内RNA结合蛋白的核心组分,参与mRNA的剪接。该研究通过抑制肺癌细胞内hnRNP B1基因的表达探索其与PKM不同同工酶表达和细胞增殖的关系。方法通过构建hnRNP B1基因特异性siRNA序列,采用质粒作为载体导入A549细胞,使siRNA在细胞内持续表达并对肺癌细胞hnRNP B1基因表达产生抑制作用,观察hnRNP B1受抑制后PKM2和PKM1表达水平的变化和对细胞增殖的影响。采用荧光定量PCR法进行各基因表达水平的检测,采用MTT实验观察细胞增殖速率。结果序列分析表明hnRNP B1基因特异性siRNA重组载体质粒A、B、C、D和无关序列组E成功构建。瞬时转染后,重组质粒A、B、C、D组hnRNP B1表达水平均下降,与未转染组相比较,抑制效率分别为42.54%,35.64%,45.38%,34.58%(P<0.05)。无关序列的重组质粒E对hnRNP B1 mRNA表达无明显抑制效果(P>0.05)。A～F各组PKM1/PKM2 mRNA相对表达量的比值分别为1.8857±0.5467,1.7771±0.7229,1.8400±0.7745,2.5231±1.2323,1.2700±0.4855,1,但经统计学分析其差异并无显著性(P>0.05)。经药物筛选后,阳性多克隆细胞pA、pB、PC、pD的hnRNP B1表达水平明显受抑,各组抑制效率分别为86.9%、60%、73%和68.8%,无关干扰组pE为27.2%；pA～pD组PKM1/PKM2的比值均>1.0,pE组<1.0。采用pA、pC、pE、F组细胞行MTT实验,结果示pE和F组细胞增殖速率无明显差异(P>0.05),pA组细胞增殖速率与pE、F组细胞无明显差异(P>0.05),pC组细胞增殖明显慢于pE和F组细胞(P<0.05)。结论本实验通过构建hnRNP B1干扰载体,抑制A549细胞中hnRNP B1基因的表达,减慢了A549细胞增殖过程。同时,hnRNP B1受抑制后PKM1/PKM2比值表现出上调趋势,提示hnRNP B1可能通过改变PKM不同同功酶表达水平影响肺癌A549细胞糖酵解代谢,进一步影响细胞增殖。