干扰素是单核细胞分泌的具有高活性、多生物功能的细胞因子。自从1957年IFN被发现至今,对IFN的研究和产品研发一直在持续。干扰素在抗病毒、抗肿瘤以及在免疫调节中起到至关重要的作用。IFNα-2b是IFN大家族中最早被发现的亚型之一;也是临床治疗中应用最广泛的品种之一,在众多类型的干扰素中,IFNα-2b的抗病毒、抗肿瘤、机体免疫调节能力最强,因此,IFNα-2b在多种疾病治疗中发挥不可替代的作用。目前,大多数医药生产企业的IFNα-2b制备方式仍沿用包涵体变复性的形式,尽管,随着生产水平的提高其复性率有所增加,但产品中依然残存无活性的错配体,导致产品活性较低,药品质量存在严重缺陷。拥有诸多生物活性的rhIFN,在临床应用中有着极其重要地位,尤其是在乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病和卡波其肉瘤、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤等癌症治疗中起到重要作用,但rhIFN也存在其他生物药剂的通病:即副作用大;半衰期短;容易产生中和抗体等弊端。因此,对它进行结构改造和修饰的研究仍在继续。长效干扰素作为干扰素的衍化产物,是利用点击化学的理论,通过有机化学中各种反应,使干扰素中游离的基团与无毒无害无刺激的PEG进行偶联得到的复合产物。偶联后的长效干扰素拥有干扰素的众多优点,并且具有更大的分子量,更长半衰期;尽管PEG的加入使得干扰素的生物学活性有所降低,但降低了它的副作用并减少了中和抗体的产生。本实验针对干扰素IFNα-2b在原核生物中只能以包涵体形式表达的现状,利用基因工程将其进行改造,添加分子伴侣TrxA、Smt3等,使其能够达到可溶性表达的目的,并利用简便的纯化技术,使用高效SUMO酶等试剂将其提纯。对纯化的干扰素蛋白使用单甲氧基化的mPEG-SPA20000进行定点修饰。以极其简便的纯化步骤及方式将单偶联聚乙二醇的干扰素mPEG-IFNα-2b提纯出来。最后,利用高压液相色谱以及体外活性实验对其纯度及生物活性进行检验。实验内容I:利用多分子伴侣表达载体在大肠埃希氏菌中融合表达人干扰素IFNα-2b,并进行IFNα-2b纯化工艺的研究;使用细菌培养、质粒提取、质粒酶切与连接、菌体诱导表达、蛋白纯化等技术,将人工设计并合成Smt3-IFNα-2b克隆至自行构建的P32-TrxA载体中,将重组表达质粒P32-TrxA-Smt3-IFNα-2b转化至大肠埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析,表明IFNα-2b呈可溶性表达形式存在,在此基础之上再利用诸多层析方法:MCAC技术、SUMO蛋白酶酶切、IEC技术以及GFC层析技术等提纯了干扰素IFNα-2b,并建立了以IFNα-2b可溶性表达形式为基础的全新制备工艺。实验内容II:利用第二代聚乙二醇对IFN的定点修饰的特点,在反应中得到单聚乙二醇修饰的长效干扰素,并进行mPEG-IFNα-2b纯化工艺的探索;根据对本实验中涉及的干扰素IFNα-2b、聚乙二醇性质的报道的研究,选用mPEG-SPA20000对其进行偶联,使用生物学统计软件,对聚乙二醇与干扰素偶联实验条件进行5因素4水平的正交试验设计,选取最佳的偶联反应条件,进行试验。通过使用各种层析方式,如:MCAC技术、AC技术、以及GFC技术,获得了纯度高、生物活性较好的单聚乙二醇偶联的干扰素mPEG-IFNα-2b,形成了较系统的mPEG-IFNα-2b纯化工艺。实验内容III:利用干扰素及长效干扰素的抗病毒、抗肿瘤特性,对人羊膜细胞及各种肿瘤细胞进行体外生物活性研究;使用Lowry试剂法及BSA试剂法测定两种蛋白浓度,使用高效液相色谱对两种干扰素进行纯度测定,并且使用含10%FBS的RPMI1640和10%FBS的DMEM透析后过滤除菌,依照《中华人民共和国药典》(2015版)对其进行细胞病变抑制实验,测得两种干扰素的抗病毒活性,并通过体外细胞实验,检测两种干扰素对不同肿瘤细胞的抑制和杀灭效果。