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家蚕作为鳞翅目昆虫的代表,具有重要的经济价值。家蚕生长发育过程会受到各种病原微生物的威胁,其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的家蚕病毒病占蚕病的70%,对蚕业生产造成了严重影响。围食膜(PM)是昆虫抵抗外源病源微生物入侵的第一道防线,围食膜因子与外源病原微生物入侵昆虫中肠细胞存在密切关系。研究家蚕围食膜因子在幼虫感染BmNPV过程中的功能,可为抗性育种和害虫防治提供新的基因资源和理论依据。本文以家蚕围食膜因子基因Bm011851为研究对象,克隆并分析了家蚕围食膜因子基因Bm011851,获得并检测了过表达Bm011851转基因家蚕幼虫的生长发育、经济性状及其对PM表面结构的影响,研究了Bm011851在BmNPV感染家蚕幼虫过程中的功能,以解析Bm011851参与抵抗病毒入侵的机制。主要研究结果如下:1.家蚕围食膜因子基因Bm011851的克隆及表达分析基因表达分析显示Bm011851在家蚕幼虫期表达,进食期表达量高于眠期,5龄时表达量达到最高水平,5龄6天后表达量开始下降;Bm011851在中肠中高量表达,且中部中肠和后部中肠表达量高于前部中肠,在前肠、后肠和其他组织器官中几乎不表达。克隆结果显示Bm011851的ORF全长为1620 bp,编码539个氨基酸,推导的蛋白质序列无O-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点,有1个跨膜结构域和1个N-端信号肽。4龄幼虫经口感染BmNPV后3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、48 h、78 h、84 h,中肠组织中Bm011851表达显著上调。2.过表达Bm011851转基因家蚕的获得构建了pBac[3×P3-dsred-SV40+OpIE2-Bm011851-V5-His-OpIE2_pA]转基因过表达载体,并进行蚕卵的显微注射,筛选获得阳性家蚕。分子生物学检测发现Bm011851成功在家蚕中过表达。统计转基因品系家蚕幼虫的体重、全茧重、茧层量、茧层率等,发现过表达Bm011851不影响家蚕的正常生长发育和主要经济性状。扫描电镜观察发现转基因过表达Bm011851没有直接影响PM的表面结构。qRT-PCR检测发现转基因家蚕中其他围食膜因子基因Bm001504、Bm009641、Bm001491、Bm000185的表达与对照相比,无明显变化。表明获得的转基因家蚕能用于Bm011851的功能研究。3.Bm011851基因在BmNPV感染家蚕幼虫过程中的功能研究调查发现转基因过表达Bm011851基因能提高BmNPV感染后幼虫的存活率,且BmNPV半致死剂量较对照相比提高了约10倍。过表达Bm011851能抑制BmNPV增值复制必须早期基因(ie1)、中期基因(vp39)和晚期基因(p10)的表达。扫描电镜观察转基因家蚕感染BmNPV后不同时间点PM表面结构,发现过表达Bm011851能减轻BmNPV对PM的破坏程度,有利于维持PM的完整性。中肠组织切片观察发现Bm011851能减轻BmNPV入侵过程中对家蚕中肠细胞的破坏,维持中肠细胞的稳定性。围食膜因子可能通过抑制病毒复制、影响PM完整性和中肠组织细胞稳定性来影响BmNPV对家蚕幼虫的侵染。其中的机制需要进一步研究。