论文部分内容阅读
禽（番鸭）呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，DRV）是新近发现的番鸭“肝白点病或花肝病”的病原。该病的主要临床特征是精神萎顿、软脚、排绿色带有粘液稀粪、部分病鸭趾关节或跗关节有不同程度的肿胀及耐过鸭生长发育受阻；主要病理变化为肝、脾表面有多量小白点、肾脏肿大、出血、表面有黄色条斑。在患病番鸭中，雏番鸭最为易感，死亡率很高。番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，DRV）是呼肠孤病毒属（Reovirus genus）第Ⅱ亚群中禽呼肠孤病毒（Avian reovirus）的成员，具有禽类呼肠孤病毒的共同特性。临床该病主要见于番鸭，夏季多发，发病日龄4～45日龄，发病率20％～90％，死亡率差异很大，一般10％～30％，应激或混合感染时高达90％以上，耐过番鸭生长发育迟缓、成为僵鸭，严重危害到番鸭养殖的健康发展，仅我省莆田县2000年因该病死亡番鸭即达2000万羽以上，番鸭养殖业受到沉重打击。该病毒的福建分离株YB株的S3（1104bp）与S4ORF2（810bp）基因，分别编码病毒的外衣壳蛋白σB和吸附蛋白σC，利用该基因作为免疫原可以诱导机体产生特异中和抗体。因此，如果能利用其这一特性研制DNA疫苗将为禽（番鸭）呼肠孤病毒的免疫预防提供新的途径。为了研究S3与S4ORF2基因DNA疫苗，我们以含CMV启动子—增强子的pCI质粒，分别构建真核表达质粒pCIS3和pCIS4ORF2，并且分别通过PCR鉴定和酶切鉴定，结果表明：本试验成功构建了pCIS3基因DNA疫苗质粒和pCIS4ORF2基因DNA疫苗质粒。我们建立间接ELISA方法以检测禽（番鸭）呼肠孤病毒抗体。制备了阳性血清（琼扩效价为1∶16）、阴性血清、二抗（兔抗番鸭）阳性血清（琼扩效价为1∶128），提纯二抗并标记HRP酶，获得合格的酶标二抗。建立了间接ELISA检测方法：抗原稀释40倍，酶标二抗稀释400倍，血清稀释40倍，临界值为0.5。结果判定：以能产生阳性反应的血清最高稀释度为该血清的终点抗体滴度。为了监测单独、联合使用DNA疫苗对免疫番鸭形成免疫保护效果，分别以pCIS3、pCIS4ORF2、pCIS3+pCIS4ORF2，100μg的免疫剂量分别肌肉注射免疫2日龄番鸭，对照番鸭则以PBS肌肉注射免疫。首次免疫1周后以相同剂量和途径加强免疫，加强免疫后1周后用TCID50为10-7.1934／0.1ml病毒液肌肉注射攻毒，攻毒量为：0.2ml／只，观察发病与死亡情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清抗体滴度的动态变化。结果：除对照组外，所有免疫组在加强免疫后攻毒前抗体均转阳，并且抗体滴度水平都在1∶20以上，攻毒后联合免疫组最高滴度水平达到1∶320，而其他组滴度水平则为1∶160。100μg剂量免疫，pCIS3+pCIS4ORF2联合可对免疫番鸭形成100％完全保护，个别发病，但不死亡；100μg剂量免疫，pCIS3可对免疫番鸭形成80％保护，较多发病；100μg剂量免疫，pCIS4ORF2对免疫番鸭形成90％保护，个别发病。实验证明pCIS3+pCIS4ORF2联合免疫效果比单独使用pCIS3或pCIS4ORF2免疫效果好。为了探索免疫佐剂的添加对免疫效果的影响，选择免疫效果较好的pCIS3+pCIS4ORF2联合基因疫苗，分别采用添加适量的白油、甘油、氢氧化铝佐剂免疫方法免疫，免疫程序同第一次动物实验。结果：所有免疫组在加强免疫后攻毒前抗体均转阳，并且抗体滴度水平都在1∶40以上，攻毒后添加白油佐剂联合免疫组最高达到1∶640。100μg剂量免疫，白油、甘油、未加佐剂联合免疫组可对免疫番鸭形成100％完全保护，有发病，但不死亡；而添加氢氧化铝佐剂组免疫保护率仅为70％。实验证明添加白油佐剂具有比较好的效果，添加佐剂免疫获得的抗体滴度比不添加佐剂要来的高。