乳酸链球菌肽,即Nisin,是乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)部分菌株产生的由34个氨基酸组成的一类细菌素,它不同于抗生素,是由核糖体编码并进行翻译后修饰形成的活性寡肽。与Nisin生物合成有关的基因共11个,组成一个基因簇,包含nisABTCIPRKFEG,大小约14kb。其中,nisA编码57个氨基酸组成的Nisin前体,它由位于细胞膜上的脱水酶NisB和环化酶NisC修饰形成含有脱氢丙氨酸、脱氢丁氨酸、羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等非编码氨基酸及通过硫醚键形成五环结构的乳链菌肽前体,最后该前体被NisT转运蛋白运输至细胞外并由NisP蛋白酶切割获得成熟的Nisin。由于Nisin对人体无害,且热稳定性好,尤其在酸性条件下对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等食源性腐败菌具有强烈抑制作用,是一类重要的天然食品防腐剂。虽然Nisin被批准应用于食品防腐已有30余年的历史,但是产量低、分离纯化步骤繁琐、检测方法灵敏性差依然是限制Nisin大规模使用的瓶颈。为解决上述问题,本论文以产生Nisin的L.lactis为出发点,建立快速准确的检测方法,同时在同源及异源宿主内进行过量表达以期提高Nisin产量,最后建立适于工业生产的分离纯化体系,具体研究内容和结果如下。1.Nisin检测方法的优化(1)平板法检测条件优化牛津杯法是抑菌物质筛选和检测常用方法,具有实验周期短且操作简单的特点。然而由于乳酸菌代谢产物复杂,其中乳酸、乙酸等会对Nisin的检测结果产生干扰;同时由于Nisin属于蛋白类物质,在介质中扩散性较差,也是影响其检测结果的主要原因。针对这些问题,本章对牛津杯法检测Nisin的条件进行优化。结果发现,当向半固培养基中添加分散剂(1%吐温-20)、降低琼脂硬度至0.5%,延长待测物4 ℃下预扩散时间至12 h后,Nisin产生的抑菌圈直径扩增至原来的150%,增强检测的灵敏性;向半固培养基中添加1%磷酸氢二钠作为缓冲剂可以排除酸抑制的作用,但磷酸氢二钠的缓冲能力有限,当选用耐酸性强的L.lactis MG1363作为指示菌时,受酸抑制的结果被排除,由此提高检测结果的准确性。(2)高压液相色谱法检测Nisin分子量小,目前对其纯度及半定量检测时使用Tricine-SDS-PAGE,尚无成套的高效液相色谱法(HPLC)。根据Nisin的化学性质,从色谱柱、流动相和洗脱条件三个方面设计了一套则简便的HPLC程序,其方法为:利用C18反向色谱柱,以A液(水)和B液(异丙酮:三氟乙酸,500:1,v/v)为流动相进行梯度洗脱,B液浓度在20 min内从10%上升到40%,接着在10 min内上升到100%,最后在5 min内回到10%,保持该浓度进行至结束(60 min),在220 nm的波长下检测吸收峰。应用该方法,在27 min得到了清晰的色谱吸收峰。2.利用同源及异源宿主过量表达NisinNisin产量低是限制其应用的主要原因。传统的物理诱变方法如微波诱变、紫外诱变等获得的突变株Nisin产量增加幅度有限且菌株表型不稳定。相比之下,Nisin的合成基因簇遗传背景清晰,使用基因工程的方法过量生产Nisin更具潜力,本章分别使用同源或异源宿主,过量表达Nisin合成基因簇,来提升Nisin的产量。(1)Nisin在Lactococcus lactis中的过量表达由于Nisin产生菌本身具有Nisin的免疫系统,过量合成Nisin后不会对菌体细胞产生杀伤作用,所以本文首先使用Nisin产生菌L.lactis SDMCC050017和SDMCC050348为宿主菌同源表达Nisin合成的结构基因nisA和修饰基因nisBTC。结果以SDMCC050017为宿主同时组成型表达nisA和nisBTC对Nisin产量影响不大,而单独组成型表达nisA时Nisin产量较野生菌株提高50%;以SDMCC050348为宿主时,上述两种基因表达方法均未能提高Nisin产量,分析原因可能是由于菌株SDMCC050348的Nisin产量较高,进一步过量表达Nisin对其合成途径产生了反馈抑制。(2)Nisin在Saccharomyces cerevisiae和Escherichia coli中的过量表达S.cerevisiae和E.coli是目前应用最为成熟的异源表达宿主,本文分别使用这两种宿主对Nisin进行异源过量表达。结果以S.cerevisiae为宿主时,表达产物经过Tricin-SDS-PAGE检测得到与预期分子量相符的条带,但是牛津杯法检测并无抑菌活性,说明以S.cerevisiae为宿主没有得到成熟的Nisin,这可能是由于Nisin的前体在S.cerevisiae细胞内未进行正确的修饰。以E.coli为宿主,利用pET系统重组表达nisABTC,产物经过胰蛋白酶切割后获得具有诱导活性和抑菌活性的重组Nisin。此外我们探究了E.coli中重组表达Nisin的C-末端His标签对Nisin活性的影响,结果表明His标签会使Nisin丧失抑菌活性和大部分的诱导活性。由于胰蛋白酶在切割Nisin前导肽的同时也会破坏Nisin内部肽键,造成终产物损失,因此我们还通过异源表达Nisin合成基因簇中的NisP代替胰蛋白酶,成功地对Nisin前体进行体外切割。3.建立快速、简易的Nisin分离纯化体系Nisin的纯化一般涉及多个步骤,包括盐析、有机溶剂萃取、离子交换色谱以及HPLC等,整个过程繁琐而耗时。由于L.lactis的培养基成分复杂,氮源含量高,发酵液中残留杂蛋白干扰后续的分离纯化。通过优化培养基中的氮源含量,在保证Nisin生物合成的基础上,尽量降低残留杂蛋白量,则可以使分离纯化步骤更为简便,且有效降低生产成本。以原有的发酵培养基为基础,对培养基中的两大氮源物质——蛋白胨和酵母粉的含量进行了大幅度的调低,并最终将用量控制在原来的10%,优化后的培养基配方为(g/100mL):蔗糖3,蛋白胨0.2,酵母粉 0.15,KH2P040.77,K2HP04 2.12,NaCl 0.2,MgS04.7H2O 0.02,吐温-80 0.1 mL。实验结果显示,在杂蛋白含量大大降低的情况下,Nisin产量未发生变化。大孔吸附树脂是一类具有孔道、没有交换集团的高分子聚合物吸附剂,它们性质稳定,具有较大的比表面积,可以依靠其与化合物之间的范德华力,对一些有疏水基团的生物大分子物质进行吸附。我们尝试了几种浓缩Nisin的方法,只有大孔树脂法可以将Nisin浓缩大约20倍。进一步优化吸附条件,发现向提取液添加0.8%的树脂,在37℃下摇瓶吸附6 h,可以达到最佳吸附效率。吸附后通过70%乙醇进行洗脱,洗脱后产物用Nisin活性缓冲液(pH=2.5)稀释5倍,于旋转蒸发仪上低温(30 ℃)悬蒸乙醇,待乙醇除净后,将温度调至50℃将多余的水悬蒸出去,最终使纯化液体积等于稀释前溶液体积,经Tricine-SDS-PAGE检测后得到了比较单一的Nisin条带。本体系的操作依赖于Nisin的热稳定性和其在乙醇水溶液中的稳定性,对生产设备要求较低且工业流程简单易行,适于Nisin的大规模分离与纯化。