实验背景乳腺癌是一类高度异质性的恶性肿瘤,5年发病率统计数据表明,中国乳腺癌患者占全世界总数的近11%。且其发病趋势:发病率迅速上升,发病年轻化,严重威胁女性的健康。据WHO的组织学分类方法,乳腺癌分为浸润性和非浸润性两大类。其中浸润性癌中以非特殊型浸润性乳腺癌(invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified,IDC-NOS)最常见,是乳腺癌最常见的病理类型。与小叶癌或小管癌相比,缺乏丰富的特征表现,且其异质性极大。IDC-NOS患者不仅疗效个体化差异明显,而且预后也不尽相同。因此,研究IDC-NOS的分子生物学特征、探索IDC-NOS相关基因及其标志物,用于早期发现、监测及预后判断,甚至作为靶向治疗的新靶点,具有重要的科学价值和现实意义。造血祖细胞激酶(Hematopoietic progenitor kinase 1,HPK1),也称MAP4K1,基因ID:11184,位于:19q13.1-q13.4,是哺乳动物细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超家族(Serine/threonine kinases,SLK)的一员,属于微管相关蛋白。近年来的研究发现HPK1与人类多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。HPK1可抑制肺癌细胞增殖、浸润和转移;HPK1的缺失在胰腺导管癌的发病过程中亦起到重要作用。提示HPK1在一些恶性肿瘤发生发展过程中起到了重要作用,但HPK1在乳腺癌中的研究目前未见相关报道,尤其在IDC-NOS中的表达及生物学功能目前仍不明确。本课题初步尝试探讨HPK1在乳腺癌中的研究,通过从临床病例,到细胞实验和动物模型三部分,层层递进,验证HPK1可能在IDC-NOS中的作用及其机制,为临床上诊疗IDC-NOS提供新的参考。首先,在临床IDC-NOS患者癌变组织中进行HPK1表达的筛查、并分析其表达与预后相关指标和患者生存期的相关性。其次,在实验室中对HPK1低表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7,通过慢病毒转染HPK1基因,构建HPK1稳定过表达株乳腺癌细胞系,并测定其生物学行为和细胞内信号通路的变化。最后,通过在裸鼠内皮下移植HPK1低表达和过表达的人乳腺癌细胞株,构建皮下移植瘤动物模型,探讨HPK1的表达在动物模型体内对移植瘤生长的影响。实验目的1.检测HPK1在IDC-NOS组织中的表达情况,分析HPK1表达与预后相关指标、患者生存期的关系,明确HPK1在IDC-NOS中的研究意义。2.利用慢病毒载体感染乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系,筛选出HPK1稳定过表达细胞系,比较HPK1基因稳定过表达的MCF-7和MDA-MB-231细胞组(MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1)与未转染的细胞组(MCF-7,MCF-7-con,MDA-MB-231,MDA-MB-231-con)的生长增殖、凋亡、细胞周期、侵袭能力等生物学特征的差异,检测HPK1相关分子通路MAPK通路下游相关靶基因JNK、p53和蛋白表达量的变化,明确HPK1基因对IDC-NOS相关细胞系的作用及相关分子机制。3.构建裸鼠移植瘤模型,检测HPK1表达调节对体内肿瘤生长的影响,进一步明确HPK1的表达在动物IDC-NOS移植瘤模型体内的作用及相关的机制。主要内容:第一部分:HPK1在IDC-NOS组织中的表达及意义方法:1.于我院标本库中筛选符合标准的IDC-NOS病例,收集相关的病例资料和对应的石蜡标本,采用免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)检测HPK1蛋白在IDC-NOS组织与癌旁组织中的表达差异。2.蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR)检测ER阳性IDC-NOS癌组织与癌旁组织中HPK1的表达差异。明确HPK1表达与肿瘤分期、经典指标(ER、PR及Her-2蛋白)、组织学分级等临床病理特征的相关性。通过生存分析和风险回归模型探讨HPK1对乳腺癌患者预后的预测意义。结果:1.入选IDC-NOS患者148例,年龄29-78(52±0.3)岁,随访时间1-80(62±1)月。IDC-NOS组织中,HPK1的m RNA和蛋白阳性率均为36.5%(54/148),ER蛋白阳性率为67.6%(100/148);其中HPK1蛋白在ER阳性组中的阳性率为28%;HPK1蛋白与ER阳性存在明显负相关(P<0.05,r=-0.254)。PR与Her-2蛋白在IDC-NOS组织中的阳性率分别为43.2%(64/148)和32.4%(48/148),与HPK1均无明显相关性(P均>0.05)。2.在ER阴性组中HPK1表达与预后无明显相关。在ER阳性患者中,HPK1阳性表达、腋窝淋巴结转移和TNM均是影响总生存期的独立预后因素(P<0.05),其中HPK1阳性者总生存期(Overall survival,OS)更长(P<0.05)。RT-PCR显示IDC-NOS与癌旁正常组织中HPK1 m RNA水平无差异(P>0.05),而WB显示IDC-NOS的HPK1蛋白明显低于癌旁组织(P<0.05)。第二部分:构建和筛选HPK1稳定过表达乳腺癌细胞系,测定其相关生物学行为和细胞内信号通路的改变方法:1.构建HPK1基因慢病毒表达载体pCDH-HPK1-puro,通过克隆菌落PCR,酶切以及DNA测序分析鉴定出阳性克隆。利用lipofectamine 2000将p CDH-HPK1-puro、包装质粒p CMV-d R8.2 dvpr和p CMV-VSVG转染至HEK293T细胞中,获得慢病毒Lenti-con和Lenti-HPK1的扩增。筛选获得MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1稳定过表达细胞株。2.MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1稳定过表达细胞株的鉴定:利用RT-q PCR、蛋白免疫印迹(western blot)和免疫细胞化学染色法鉴定稳定过表达细胞系中HPK1的表达情况。3.利用MTT实验检测HPK1基因过表达对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的细胞增殖能力的影响;4.利用软琼脂克隆形成实验检测HPK1基因过表达对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7克隆形成能力的影响;5.通过流式细胞仪检测HPK1基因过表达对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响;6.利用TUNEL实验检测HPK1基因过表达对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡的影响;7.利用细胞划痕实验、Transwell实验检测HPK1基因过表达对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的细胞侵袭能力的影响;8.利用Western blot检测HPK1过表达对乳腺癌细胞系肿瘤生物学行为相关蛋白(caspase3、PTEN、Ki-67、MMP9和Fbxw8)及MAPK信号通路中下游相关靶基因JNK和p53蛋白表达的影响。结果:1.pCDH-HPK1-puro慢病毒表达载体构建成功。慢病毒载体酶切产物为单一条带,大小为2500bp左右,与预期一致,测序结果与NCBI中HPK1参考序列一致,表明HPK1基因过表达慢病毒载体p CDH-HPK1-puro构建成功。2.RT-qPCR和Western blot检测HPK1表达情况,均提示在MDA-MB-231和MCF-7细胞系过表达组的HPK1的相对表达量明显升高(P<0.05)。细胞免疫化学法检测HPK1蛋白在各组细胞中的表达情况,HPK1的稳定过表达细胞系中HPK1蛋白表达明显上升,提示稳定过表达细胞系构建成功。3.MTT实验结果显示在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系中HPK1基因的过表达明显抑制了细胞增殖(P均<0.05)。4.软琼脂克隆形成实验显示HPK1基因过表达对MDA-MB-231细胞克隆形成影响无显著性差异(P>0.05),但可以使MCF-7细胞克隆形成数量显著性下降(P<0.01)。5.流式细胞仪检测提示HPK1基因过表达对MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系凋亡的影响无显著性差异,对MDA-MB-231细胞系周期的影响亦无统计学意义(P均>0.05),但HPK1基因过表达可以使S期和G2期MCF-7细胞的数量极显著下降(P<0.001),表明HPK1基因可以使细胞株MCF-7细胞周期阻断在G1期。6.TUNEL实验结果显示HPK1基因过表达可明显促进MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系凋亡的影响具有统计学差异。7.划痕愈合实验和Transwell实验结果显示HPK1基因过表达可明显抑制MDA-MB-231和MCF-7两株乳腺癌细胞系侵袭能力,P值均<0.05。划痕实验的P值分别为0.0018,0.0306;Transwell实验的P值分别为0.0023,0.0102。8.HPK1转染前后对比,在乳腺癌细胞系MCF-7中,ER、Caspase3、Ki-67、PTEN及MMP9的表达量差异显著(P<0.05),在乳腺细胞系MDA-MB-231中,Caspase3、Ki-67、PTEN、Fbxw8及MMP9的表达量差异显著(P<0.01),证实上调HPK1可影响乳腺癌细胞系的增殖、浸润转移。转染HPK1前后对比:在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,上调HPK1表达可显著增加MAPK通路相关重要信号因子JNK及P53的蛋白表达,而在乳腺癌细胞系MCF-7中,上调HPK1表达仅促进了JNK蛋白的表达。第三部分:HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响方法:1.通过在裸鼠腹部乳腺脂肪垫左下象限内接种乳腺癌细胞悬液,构建裸鼠抑制肿瘤模型,根据皮下接种细胞种类分成6组,依次为MDA-MB-231组、MDA-MB-231-con组、MDA-MB-231-HPK1组、MCF-7组、MCF-7-con组、MCF-7-HPK1组,每组15只,每只接种107个/200μl,至接种第28天每组随机选取5只处死,解剖出移植瘤,测量移植瘤大小及重量,剩余每组10只继续实验,用于生存率分析。2.检测HPK1表达调节对乳腺癌体内肿瘤生长的影响。按时测量HPK1不同表达组裸鼠瘤体肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线。3.测定HPK1不同表达组移植瘤裸鼠生存率。4.免疫组化检测HPK1及MAPK-p53-JNK经典通路中下游相关靶基因p53和JNK的蛋白在各组移植瘤组织中的表达。结果:1.裸鼠移植肿瘤模型均构建成功。2.移植裸鼠模型结果提示HPK1表达上调后MCF-7及MDA-MB-231细胞的成瘤体积、重量均较空白组、对照组显著性降低(P<0.01)。上调HPK1表达可抑制裸鼠瘤体的生长。3.上调HPK1表达可提高移植瘤裸鼠的生存率。实验结束时:MDA-MB-231组中,HPK1过表达组生存率(66%)明显高于空白组(35.049%)和对照组(35.294%)。MCF-7组中,HPK1过表达组生存率(71.296%)明显高于空白组(30.720%)和对照组(33.083%)。4.免疫组化结果显示:在MCF-7组中及MDA-MB-231组中,HPK1表达上调,JNK和P53表达均随之上调,呈正相关趋势。结论:1.在临床IDC-NOS病例中发现,HPK1基因在乳腺癌癌旁组织中表达明显高于IDC-NOS组织,而在IDC-NOS组织中的表达量与阳性ER呈负相关,与生存时间正相关,HPK1可能与IDC-NOS的发生发展密切相关。2.在成功构建稳定过表达HPK1的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系中,上调HPK1表达可以有效抑制乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖及侵袭能力,并可促进乳腺癌细胞的凋亡。上调HPK1表达可导致MCF-7细胞阻断在G1期。3.在动物体内实验中HPK1表达上调可抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231体内成瘤能力,提高裸鼠生存率。体内实验证实HPK1在乳腺癌中发挥抑癌效应。HPK1对乳腺癌的作用可能与其调控MAPK通路中关键位点基因JNK和p53的表达有关。