呼吸道感染尤其是下呼吸道感染是全世界面临的重大公共卫生问题,多发于老人、儿童等免疫力低下人群,具有很高死亡率。下呼吸道感染病原类型包括细菌、真菌、病原虫、病毒等多种,这给临床快速诊断和合理用药带来不小的难度。传统的病原培养方法是“金标准”,但存在耗时长,检测通量小的缺点。为了及时控制病情,临床上常常不得不进行经验性用药,待得到培养及药敏测试结果后再进行调整,这在某种程度上也使得下呼吸道病原菌耐药形势日益严峻。因此,开发新的、更准确、快速、高通量的下呼吸道感染病原检测方法具有重大意义。本研究结合多重PCR与第二代高通量测序技术开发了一种下呼吸道病原微生物检测方法,命名为AC-seq。从核酸提取的破碎条件优化,引物设计及验证,多重PCR检测体系的优化几个方面初步建立并优化了检测体系;然后使用该检测体系对34例疑似下呼吸道感染患者的肺泡灌洗液样品进行鉴定并和培养法进行比较。首先,选择20种临床较为常见的下呼吸道感染病原,包括12种革兰氏阴性细菌,6种革兰氏阳性细菌,2种真菌作为检测目标。选择屎肠球菌(Enterococcus faecium ATCC19434)和白色念珠菌(Canidia albicans ATCC 10231)这两种细胞壁较厚、较难破碎的菌作为代表进行物理破碎细胞壁条件的摸索。选择微珠自动化研磨法,使用不同粒径组合和质量的玻璃珠,氧化锆微珠和钢珠,最终确定本研究中最佳物理破碎条件:0.1 mm和0.5 mm的玻璃珠混合物0.7 g/0.5 ml菌液,对两种病原菌的破碎效率分别为99.97%和100%。同时,靶向20种病原菌的特异序列每个目标设计2对引物,共设计了40对特异性引物,并证实了引物对的敏感性和特异性良好。然后,以肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae ATCC 49619)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC43300)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli ATCC 35150)、白色念珠菌(Canidia albicans ATCC 10231)为检测目标模拟临床样品,建立并优化多重PCR体系。以尽可能减少PCR扩增产生的引物二聚体为目标,对多重PCR环节中的一轮PCR吸附磁珠添加比例、引物mix体积、一轮PCR循环数、漂洗液体积、磁珠品牌进行优化或选择,确定了一轮PCR吸附磁珠添加比例为0.7×(28μl),引物mix体积4μl,一轮PCR循环数19个循环,两轮漂洗液比例分别为2×BW15(80μl)和2×BW11(80μl),并选择一种品牌磁珠作为最终参数,使针对模拟样品的多重PCR反应产生的引物二聚体减少到荧光计无法检出的水平。接着,对所有引物对的扩增均一性进行调整,使均一值从0～6.57变为0.1～2.5之间,即表明各对引物在同一扩增体系内的扩增效率更为均衡。以1例临床样品进行优化前后的对比测试,发现优化后引物二聚体的含量减少了55.63%,目标产物的测序reads没有显著下降(P=0.44>0.05))。对优化后的检测体系进行灵敏度检测,得到该方法的灵敏度为5×10~0copies。最后,将该方法应用到34例临床肺泡灌洗液样本的检测中,阳性率为79.41%,比传统培养方法(32.35%)高2.45倍;该方法共从临床样品中检出13种病原菌,培养法仅检出8种,两种方法均显示嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为主要检出类型,两种方法总一致率为50%。检测敏感性达到100%。总之,本研究初步建立了一种基于多重PCR和第二代高通量测序技术的下呼吸道病原检测方法,能够实现对20种常见下呼吸道病原细菌的敏感高效检测,在临床呼吸道病原检测方面具有一定的参考价值和应用潜力。