论文部分内容阅读
树突细胞（DC)是机体内重要的抗原递呈细胞，在机体的免疫应答中起关键作用。DC表面表达丰富的模式识别受体（PRRs)，主要包括Toll样受体（TLRs)和C-型凝集素受体（CLRs)。其中，TLRs主要是通过与病原体的相互作用介导免疫激活，有利于病原体的清除，而CLRs则更倾向于介导机体的免疫耐受。近些年来的研究表明，CLR家族的一个成员，巨噬细胞半乳糖型凝集素（MGL)，参与了多种病原体的免疫逃逸。在本研究中，我们构建了4种MGL原核表达载体，用以选择MGL表达的最佳条件，其次，构建了2种MGL真核表达载体，用于不同类型细胞的转染。我们首先从外周血中分离单核细胞，经细胞因子诱导成为未成熟树突细胞（iDC)，然后提取iDC总RNA并将其逆转录为cDNA。经PCR获得MGL胞外基因片段，通过酶切连接构建了2种带有MGL胞外区的原核表达载体pET-28a(+)-MGL (胞外）和pGEX-6p-l-MGL (胞外）。将其在大肠杆菌中诱导表达，经蛋白表达形式分析发现，目的蛋白均以包涵体形式存在。为获得可溶性的目的蛋白，我们又构建了带有MGL全长基因片段的pET-28a(+)-MGL和pGEX-6p-l-MGL2种原核表达载体，通过在大肠杆菌中诱导表达和蛋白表达形式分析发现，只有pGEX-6p-l-MGL表达的目的蛋白大部分以可溶性形式存在。随后，将其转化菌体表达的上清蛋白，经GST琼脂糖亲和层析的方法进行纯化，得到GST-MGL融合蛋白，并通过WestemBlot验证即为目的蛋白。在原核表达载体构建的基础上，我们又构建带有MGL全长的2种真核表达载体pcDNA3.1(+)-MGL和pWPXLd-MGL。其中pcDNA3.1(+)-MGL适合于贴壁细胞的转染，而pWPXLd-MGL适合于悬浮细胞的转染。MGL原核表达体系的构建对同类型凝集素的原核表达提供了设计思路，而且pGEX-6p-l-MGL原核表达载体表达的GST-MGL融合蛋白，可通过其标签GST的pulldown实验，研究与MGL共作用的受体和胞内信号转导蛋白。其真核表达载体可用于稳转细胞系的构建，对于研究依赖于MGL的细胞与细胞的识别以及MGL介导的信号通路均有重要意义。